[发明专利]一种纤维素降解方法、纤维素降解方法的工艺参数优化方法及其纤维素降解菌筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及纤维素降解技术领域，尤其涉及一种纤维素降解方法、其工艺参数的优化方法及其纤维素降解酶筛选方法。

背景技术

海南盛产椰子，大量椰壳废弃，不仅污染环境，而且造成能源浪费。椰壳内含有68％的纤维素，完全降解为葡萄糖后经酵母菌发酵为生物乙醇，可以实现资源的有效利用。

但现有纤维素降解工艺中主要存在以下的一些问题。例如，纤维素分子链牢牢连在一起，形成高结晶结构，不溶于水，具有抗解聚能力。与纤维素结合在一起的木质素对纤维素降解成葡萄糖也会形成物理屏障，木质素会不可逆无效地吸收纤维素酶，导致纤维素水解率较低。工业化规模生产高活性纤维素酶尚未能有效实现。上述这些问题使得木质纤维素酶解效率(即糖化率)较低，无法有效的实现大规模工业生产。

另外，由于化学预处理法能有效降低纤维素的结晶度，除去半纤维素或木质素，具备能耗低、周期短、效率高、条件较温和等优点。所以，在工业化应用中通常会采用酸/碱法预处理等预处理方法来降低纤维素的结晶度，除去木质素，从而实现更好的纤维素降解效果。但现有研究多针对某一具体方面或者反应机理的研究，尚未有对不同化学预处理方法进行系统分析、全面评价的研究成果。

因此，现有技术还有待发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种纤维素降解方法、其工艺参数的优化方法及其纤维素降解酶筛选方法，旨在解决现有技术在纤维素降解工业化生产中酶解效率较低的问题。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种纤维素降解工艺参数的优化方法，其中，包括如下步骤：测定木质纤维素原料各组分的含量；分别为木质纤维素原料的酸法预处理、碱法预处理以及酸碱联合预处理方法设置若干个实验因素以及为每一实验因素设置若干个水平；依据设置的实验因素及水平设计多组预处理实验条件；分别对木质纤维素原料依据所述多组预处理实验条件进行预处理；对预处理后的木质纤维素原料进行酶解并测定计算木质纤维素原料的糖化率。

所述的优化方法，其中，采用NREL法测定木质纤维素原料各组分的含量；采用葡萄糖试剂盒测定法测定计算所述木质纤维素原料的糖化率。

所述的优化方法，其中，所述依据设置的实验因素及水平设计多组预处理实验条件包括：采用正交实验设计方法，设计碱法处理的若干组预处理实验条件。

所述的优化方法，其中，所述正交实验设计使用L16(4⁴)正交表，具体包括反应时间、反应温度、纤维素降解酶用量以及碱的用量四个实验因素；每个实验因素均设置四个水平。

一种纤维素降解工艺参数的优化方法，其中，包括如下步骤：测定木质纤维素原料各组分的含量；分别为木质纤维素原料的酸法预处理、碱法预处理以及酸碱联合预处理方法设置若干个实验因素以及为每一实验因素设置若干个水平；依据设置的实验因素及水平设计多组预处理实验条件；对木质纤维素原料依据所述预处理实验条件进行预处理；对预处理后的木质纤维素原料进行酶解并且利用薄层层析法测定计算木质纤维素原料的糖化率。

所述利用薄层层析法测定计算木质纤维素原料的糖化率的步骤具体包括：确定葡萄糖的Rf值；通过苯酚硫酸法绘制葡萄糖标准曲线并计算曲线方程；测定某一预处理实验条件的木质纤维素原料酶解后的葡萄糖含量；计算木质纤维素原料的糖化率。

所述的一种优化方法，其中，所述薄层层析的展开剂pH值为5.0。

一种使用如上所述的优化方法获得的纤维素降解方法，其中，包括如下步骤：使用0.15mg的氢氧化钠，在80℃的条件下对木质纤维素原料进行预处理；将预处理后的木质纤维素原料使用1.5ml的纤维素降解酶进行处理。

一种筛选如上所述的纤维素降解菌的方法，其中，包括如下步骤：采集红棕象甲幼虫样品并制备红棕象甲幼虫的菌悬液；选择使用CMC-Na作为培养基的唯一碳源，KNO3作为培养基的唯一氮源来富集培养所述菌悬液中的纤维素降解菌；筛选并初步鉴定所述纤维素降解菌；分离纯化已初步鉴定的纤维素降解菌；对分离纯化后的纤维素降解菌进行酶活力测定。

所述的筛选方法，其中，筛选所述纤维素降解菌的具体步骤包括：将富集培养后获得的菌液进行梯度稀释；稀释后菌液涂布于培养基中培养；培养长出菌落后，再将菌落转接到初筛培养基上，通过刚果红染色法对初筛培养基进行染色并观察菌落透明圈情况。