[发明专利]一种高产异戊醇的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种高产异戊醇的基因工程菌及其构建方法和应用。其是在谷氨酸棒杆菌中表达α‑酮异戊酸脱羧酶基因kivd和醇脱氢酶基因adh3，而获得高产异戊醇的基因工程菌，所述的α‑酮异戊酸脱羧酶基因kivd的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的醇脱氢酶基因adh3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的重组菌经发酵培养12h，异戊醇的产量可高达497mg/L，是目前已报道基因工程菌合成异戊醇能力最高的重组菌。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种高产异戊醇的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

截止到2014年，我国能源消费总量全年相当于37.5亿吨标准煤，位居世界第二，但石油的储备却仅仅占有世界的2％。能源、资源和环境问题是当前人类生存和发展所面临的三大严重挑战，也是制约我国经济、社会又好又快发展的主要瓶颈。燃料乙醇、丁醇、戊醇等醇类燃料作为液体燃料，可替代或部分替代汽油做发动机燃料，减少汽油用量，缓解化石燃料紧张，减轻对原油进口的依赖，提高国家能源安全。

3-甲基-1-丁醇(异戊醇)作为正戊醇的一种同分异构体，其生产合成可通过化学和生物法得到，在化学制药、溶剂、香精、有机合成等行业有着非常广泛的用途。异戊醇作为一种用途广泛的重要有机化工原料，从世界能源需求来看，是继乙醇之后的新型液体燃料，但其有比乙醇更适合作为燃料的特性，譬如燃烧值和辛烷值与汽油更接近、具有更高的能量密度、低水溶性、可以以更高的浓度和比例与汽油混合、无需对现有车辆进行改型以及可利用现有的运输管道运送等诸多优点。随着世界化石资源的日益匮乏、石油价格的不断波动，丁醇、戊醇等生物长链醇近年成为世界科研工作者竞相研发的热点。

早前异戊醇的生产都是经由杂醇油蒸馏得到，一直没有形成大规模的工业化生产。在2008年，美国加州大学Liao的研究团队在《Nature》上率先报道了通过非发酵途径合成高级支链醇的方法。他们利用氨基酸合成的共同前体物α-酮酸为底物，在α-酮酸脱羧酶(KDC)和醇脱氢酶(ADH)的作用下生产出比直链丁醇具有更高辛烷值的支链异丁醇、3-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丁醇等生物长链醇。该研究团队通过代谢途径改造，利用亮氨酸合成的共同前提物α-酮异已酸为底物，在2-异丙基苹果酸合酶(leuA)、异丙基苹果酸异构酶复合体(leuC，leuD)和3-异丙基苹果酸脱氢酶(leuB)等基因的代谢调控下，通过碳链延长，合成出了具有6～8个碳原子的长链醇。这项研究较好地利用了已经发展成熟的氨基酸生产技术，将氨基酸生产途径与α-酮酸的脱羧和还原途径相结合来生产长链醇类。

在所有长链醇生产合成中，国内外异丁醇的生产合成研究相对较多。目前，异丁醇等生物长链醇生产所采用的宿主菌主要有大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum，C.glutamicum)等。利用大肠杆菌作为宿主菌，长链醇会对其产生毒性，即使溶液中含量为1％(V/V)的异丁醇，也会引起大肠杆菌细胞膜结构的破坏，阻止糖和营养物质的转运，从而造成大肠杆菌生长的停滞。当长链醇进入膜后，会与膜内的磷脂双分子层作用，使膜的渗透性、流动性和无序性增大，进而对微生物产生毒害作用。而谷氨酸棒杆菌作为一种目前仍然广泛使用的氨基酸生产安全菌株，由于其具有较厚的细胞壁，细胞壁中含有的分枝菌酸能与多糖等连接，形成包裹于细胞壁的双分子层膜，能够限制胞壁的渗透性，从而可以耐受更高浓度的长链醇。

经由α-酮酸的非发酵途径合成异戊醇等生物长链醇无疑为人们提供了一条长链燃料醇生物合成的新颖思路。国外在利用大肠杆菌生产异丁醇等生物长链醇方面进行了较多的探索，但在利用谷氨酸棒杆菌为宿主菌构建高产异戊醇基因工程菌方面还鲜有报道，国内更是缺乏相关支链醇的生物合成报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种高产异戊醇的基因工程菌及其构建方法。