[发明专利]含2，4‑二硝基苯磺酰基香豆素类化合物及其制备方法与应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及巯基蛋白质的检测领域，具体地说，是一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物及其制备方法与应用。

【背景技术】

细胞内蛋白质上的巯基由于其易被活性氧化物或活性氮分子氧化，可以在氧化态的巯基(-SH)和还原态的二硫键(S-S)间相互转化，在调节细胞内蛋白质的氧化还原平衡，信号传导等方面具有很重要的生理学意义。此外，含巯基蛋白质的表达与多种疾病有关，例如癌症，糖尿病，神经退性形变。因此，选择性检测细胞内的巯基蛋白具有重要的意义。

荧光法由于其灵敏度高、选择性好、操作过程简单，且可用于活体成像等优点在很多领域广受关注。香豆素荧光团具有荧光量子产率高，稳定性好等特性，是一种常用的荧光团。此类荧光团的荧光量子产率随溶剂极性的变化而变化，通常在水溶液中荧光量子产率较低，而在非极性溶剂中荧光量子产率较高，因此常用于制备极性敏感的荧光探针。2，4-二硝基苯磺酰基是一种比较常见的荧光猝灭基团，但其易被含巯基的化合物取代，常常用作荧光探针的受体单元用于检测小分子硫醇。本发明将2，4-二硝基苯磺酰基通过共价键连接到极性敏感的香豆素荧光团上，只有当荧光分子中的受体被硫醇取代且化合物同时处于非极性环境中，体系的荧光才会有明显的增强，利用此特性可以将巯基蛋白与小分子硫醇以及其它不含自由巯基的蛋白质区分开，从而 实现对巯基蛋白的特异性响应。

【发明内容】

本发明的目的在于检测含疏水空腔的巯基蛋白质，排除不含自由巯基蛋白质以及小分子硫醇的干扰，提供一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物及其在巯基蛋白质检测中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物，其结构通式：

式中：R为含氧，氮取代的烷基，生物素，吗啉，葡萄糖或者果糖；2，4-二硝基苯磺酰基在羰基的邻、间和对位。

一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其具体步骤为：

(1)将溶剂，3-甲氧基苯胺，碳酸钾，碘化钠，四丁基溴化铵TBAB以及溴乙烷加入到反应器中，将混合物加热回流4～10小时后，真空旋蒸去除溶剂；反应产物过硅胶柱，得无色油状物1；

所述的溶剂为乙腈或N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃或二甲基亚砜；

3-甲氧基苯胺和碳酸钾的摩尔比为1∶1～1∶3，优选为1∶1.5；3-甲氧基苯胺和碘化钠的摩尔比为1∶0.05～1∶0.15，优选为1∶0.1；3-甲氧基苯胺和四丁基溴化铵TBAB的摩尔比为1∶0.05～1∶0.2，优选为1∶0.1；3-甲氧基苯胺和溴乙烷的摩尔比为1∶0.8～1∶1.5，优选为1∶1；3-甲氧基苯胺以及溴乙烷二者混合物与 溶剂的固液比为7～9∶45～55，优选为3∶80；

(2)将步骤(1)得到的无色油状物1和Cs₂CO₃置于有机溶剂中搅拌加热回流；当溶液回流5～30min后再逐滴加入1，2-二溴乙烷，继续反应5～36小时；反应液冷却后抽虑，收集滤液旋干，过硅胶柱，得无色油状物2；

无色油状物和Cs₂CO₃的摩尔比为1∶1～1∶3，优选为1∶1.5；无色油状物1和1，2-二溴乙烷的摩尔比为1∶5～1∶20，优选为1∶10；

(3)将步骤(2)得到的无色油状物2加入无水有机溶剂中，氮气保护，-10℃～-78℃下逐步滴加三溴化硼的无水二氯甲烷溶液，反应10～60min后缓慢升温至室温继续反应3～24h；冰浴下加水猝灭反应，用乙酸乙酯萃取，有机相依次用饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗，清洗后旋干过硅胶柱，得无色油状物3；

无色油状物2和三溴化硼的摩尔比为1∶1～1∶10，优选为1∶2.5；无色油状物2和二氯甲烷的摩尔体积比为1∶5～1∶20，优选为1∶10；

(4)在氮气保护，冰浴下逐滴滴加三氯氧磷于有机溶剂中，保持冰浴反应15～45min，再向上述溶液滴加含步骤(3)得到的无色油状物3的有机溶剂溶液，冰浴下反应10～45min后移至室温反应5～45min，而后加热至50～90℃反应2～8h，加水猝灭反应，乙酸乙酯萃取，保留有机相；有机相依次用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水清洗，清洗后旋干过硅胶柱，得白色固体4；

三氯氧磷和溶剂的摩尔体积比为15∶1～1∶1，优选为8.25∶1；无色油状物2和溶剂的摩尔体积比为10∶1～1∶1，优选为4.1∶1；