[发明专利]一种半夏半胱氨酸蛋白酶及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及一种半夏半胱氨酸蛋白酶及其应用。

背景技术

种子的萌发对于农作物具有关键的作用，玉米，大豆，烟草，水稻等粮食和经济作物已经实现了

动物来源的半胱氨酸蛋白酶包括组织蛋白酶B、H、L等，一般存在于溶酶体，主要参与细胞吞噬和细胞内多余物质的清除和消化。近年来组织蛋白酶B(Cathepsin B，CB)的作用日受重视。正常组织中分离到的CB最适PH为酸性，在中性或碱性条件下无活性，但肿瘤组织中CB却在中性或碱性时活性更高，这似乎更适宜于恶性肿瘤的代谢紊乱。CB能降解I型胶原、LN、PG，并能活化间质胶原酶原和IV型胶原酶原，降解基质中的I、II、III和IV型胶原纤维。因而参与肿瘤的浸润转移。Smid L检测喉癌的癌组织和癌旁组织中的半胱氨酸蛋白酶及其抑制剂的浓度，结果发现癌组织中半胱氨酸蛋白酶及其抑制剂的浓度均明显高于癌旁组织中的浓度，表明它们可能参与肿瘤浸润的全过程。

植物来源的半胱氨酸蛋白酶功能比较复杂，专利201010121565.7公开了一种半胱氨酸蛋白酶在增强植物介导的昆虫RNA干扰的作用，该发明将半胱氨酸蛋白酶基因转入双子叶或者单子叶的植物中，可以改善植物的抗虫性。专利201410497324.0公开了一种四翅滨藜半胱氨酸蛋白酶的基因克隆及其应用。并且检测到该蛋白在干旱和盐胁迫的情况下响应，起到抗旱和抗盐的效果，其转基因植物的抗逆性增强。

目前，尚未有从药用植物半夏中克隆半胱氨酸蛋白酶基因并研究其功能的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种半夏半胱氨酸蛋白酶及其应用。本发明在天然有毒的中药材半夏中克隆得到了一个半夏半胱氨酸蛋白酶，该蛋白具有促进种子萌发，美白皮肤，消除黄褐斑，和抗干旱的功能。

一种半夏半胱氨酸蛋白酶，所述半夏半胱氨酸蛋白酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。

所述半夏半胱氨酸蛋白酶的基因序列如序列表SEQ ID NO2所示。

所述半夏半胱氨酸蛋白酶的基因载体。

所述半夏半胱氨酸蛋白酶的基因载体的宿主菌。

扩增所述的半夏半胱氨酸蛋白酶中任一片段的引物。

一种半夏半胱氨酸蛋白酶突变体，所述半夏半胱氨酸蛋白酶的突变体氨基酸序列如序列表SEQ ID NO3所示。

所述半夏半胱氨酸蛋白酶抑制剂突变体的基因序列如序列表SEQ ID NO4所示。

所述半夏半胱氨酸蛋白酶或所述半夏半胱氨酸蛋白酶突变体在促进种子萌发，美白皮肤，消除黄褐斑，和植物抗干旱中的应用。

本发明的有益效果：本发明在天然有毒的中药材半夏中克隆得到了一个半夏半胱氨酸蛋白酶基因，经研究，该基因具有明显的促进种子萌发，美白皮肤，消除黄褐斑，和植物抗干旱的作用。本发明还发现了上述半夏半胱氨酸蛋白酶的一个突变体，该突变体蛋白具有更高的促进种子萌发，美白皮肤，消除黄褐斑，和植物抗干旱的作用，且在体内不容易降解，半衰期长。

附图说明

图1为本发明克隆的半夏半胱氨酸蛋白酶基因鉴定电泳图；

图中，Maker：500bp Maler(500bp、1000bp、1500bp、3000bp、5000bp、7500bp、10000bp、15000bp)，1.p2301-PtCP/EcoRI+BamHI(11621bp+2111bp)。

图2为本发明构建的pCAMBIA2301-PtCP载体结构示意图。

图3为表达载体的酶切鉴定图；

图中，M：λDNA HindIII/EcoRI Marker；1：SacII与EcoRI(10606bp+2426bp)；2：BamHI与EcoRI(11600bp+1423bp)；3：BglII(9758bp+3274bp)。

图4为本发明纯化的半夏半胱氨酸蛋白酶蛋白鉴定图；

图中，M：蛋白Maker，1、2、3、4、5：PtCP蛋白纯化样品(48.8KD)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。

实施例1