[发明专利]一种组织工程角膜的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程角膜的构建方法。

背景技术

角膜是维持人体正常视力的组织之一，角膜的急性损伤、穿孔、溃疡、病变等造成的视力下降或失明，甚至眼球摘除，给患者的正常生活和心理造成极大的影响。

现今，角膜盲已成为全球第二大致盲性疾病，治疗角膜盲最为有效的方法是角膜移植，然而角膜来源缺乏，导致患者不能及时治疗而终生失明。根据统计而知，我国大约有400万角膜盲患者需要角膜移植，然而仅有不到万例的患者有供体角膜进行移植。角膜供体来源的匮乏，制约了角膜盲患者的治疗。

人体正常角膜为椭圆形，横径为11.5--12cm ，垂直径约为10.5--11mm。周边厚度约为1mm，中央稍薄约为0.6mm。其前表面的曲率半径为7.8mm，后表面为6.8mm。角膜由外向内共有5层结构，分别为上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层。角膜缘为环状区域，在角膜与巩膜交界处，是角膜的干细胞富集区域，含有大量角膜干细胞，可用于组织工程角膜的体外构建。

目前组织工程技术的发展和近年来的研究表明，在组织工程技术思想的支撑下，采用种子细胞和支架材料的方式，可以体外制备组织工程角膜，进行角膜损伤患者的治疗，甚至角膜替代移植。

目前现有技术表明（如中国专利201410264542.X和201410230365.3），其制备的人工角膜仅提供支架材料，缺乏具有活性功能的种子细胞，在植入体内进行修复时，仅依靠患者患处细胞修复能力进行损伤修复，延长了治疗过程的同时，也增加了修复失败的概率，同时，其制备的支架材料为外源性材料，植入后与患者组织相容性差，有排异的风险。

中国专利03140113.9公开了一种人工组织工程化生物角膜，采用了上皮和内皮细胞作为种子细胞，但所用载体为动物组织或异体的角膜成分，其保留了外援细胞或细胞残余组分，并且未对残余组分进行控制描述，其会引起人体的免疫排斥和病毒交叉感染，导致植入修复后患者对植入物的排异反应，造成治疗失败，同时所用种子细胞不具有分化的多潜能性，造成治疗效果的局限性，同时，此类方法，都需要采用体外培养的方式扩增细胞，改变了细胞的生存环境，加大了细胞变异的可能性，同时细胞培养过程漫长，延缓了治疗过程，而且可能面临二次手术的，给患者健康带来潜在的危害。

因此，本发明以解决上述现有技术的问题为目的，即本发明的目的在于提供模拟人体正常角膜的结构和功能，实现角膜移植治疗的替代物的功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物相容性高、透明度好、力学性能强，可应用于人体角膜移植手术的全层修复的组织工程角膜的制备方法。

该组织工程角膜的制备，包括以下步骤，

步骤一、动物源性角膜的选取和前处理：

选取包含有前弹力层的动物源性角膜，将其置于添加抗生素的、温度在2～30℃的去离子水中浸泡8～24h，待所述动物源性角膜厚度溶胀到2～5倍厚度后，该动物源性角膜的上皮细胞层会由于后弹力层胀起而脱落，同时抗生素的使用，可以有效去除该动物源性角膜组织的细菌，获得无菌的、去除了上皮细胞层的动物源性角膜组织材料；

步骤二、角膜各层的分离：

将步骤一制备所得的动物源性角膜组织材料置于角膜切削设备中，切削获得前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片，实现角膜各层的分离；

步骤三、将步骤二制备所获得的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片去抗原、病毒灭活处理后，采用质量百分比浓度为60%～95%的甘油对去抗原、病毒灭活处理后的前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片进行脱水处理，然后在2～30℃的温度条件下，使前弹力层组织片、基质层组织片和后弹力层组织片恢复至溶胀前的生理状态，同时置于所述甘油中保持待用；

步骤四、制备细胞混悬液：

将人角膜缘组织置于25～37℃预热的胰酶溶液中消化细胞，胰酶浓度为0.1%～0.25%，消化时间为1～10min，后采用人血清终止消化，800～1200rpm离心收集细胞，随后采用溶液A将收集的细胞制备成细胞混悬液，待用。

所述溶液A是体积百分数为10%～30%的人血清、胶原溶液和透明质酸溶液中的任一种或两种的混合或三种的混合溶液；

所述细胞混悬液的细胞浓度为1×10⁴至2×10⁵个细胞每毫升；

步骤五、组织工程角膜的构建：