[发明专利]一种固相介质选择性提取短片段长度DNA的方法

说明书

技术领域

本发明公开一种固相介质选择性提取短片段长度DNA的方法，利用固相介质从不同长度的DNA混合溶液中选择性提取片段长度小于200bp的短片段DNA，属于生物技术的技术领域。

技术背景

DNA提取是分子生物学、生物化学、医学等领域的一项基础工作。随着DNA分子技术在临床疾病诊断、进出口检验检疫、法医学检验、血液质量控制等领域基础与应用研究的逐渐深入。对DNA分子进行选择性提取特别是对小片段DNA（长度小于200bp）的选择性提取已经成为了DNA分析技术应用推广的一个难题。

目前商业上应用的提取DNA试剂盒主要是磁珠法，玻璃珠法等以二氧化硅为基质，采用向体系中加入高浓度的盐，通过盐桥建立的静电相互作实现DNA的吸附和脱附，从而达到提取纯化DNA的目的。然而由于该种方法依靠的是间接的静电相互作用力，它的提取效率只有70%左右，并且它对DNA的吸附没有选择性，另外对小片段DNA分子的吸附效果甚微。此外，研究者应用氨基硅烷偶联剂偶联反应，使得粒子在一定pH下带有正电，应用强直接静电相互作用吸附DNA分子，然而，这种方法脱附很难实现，不能达到对DNA的有效提取及选择性提取。而对于选择性提取DNA方面，科学研究者已经应用单链DNA与双链DNA带电性质的不同将单链DNA从两者混合物中提取出来。但是目前对选择性提取不同片段DNA分子尤其是选择性提取小片段DNA仍没有有效的措施。近年来，细胞外血浆中游离小片段DNA（cfDNA）越来越多的引起人们的重视，它的成功纯化富集对非侵入性产前诊测、恶性肿瘤早期诊断、癌症治疗过程检测等临床疾病诊疗过程具有重要意义。事实上，已经有一些公司针对cfDNA提取的需求，通过对基因组DNA提取技术的优化，推出了相关的提取试剂盒，这些试剂盒中采用硅胶膜作为提取介质，对短片段DNA有较高的提取效率，但还无法实现对短片段DNA的优势提取和不同长度DNA片段的均衡提取。

发明内容

本发明提供一种固相介质选择性提取短片段长度DNA的方法，利用固相介质从不同长度的DNA混合溶液中选择性提取片段长度小于200bp的短片段DNA，提取效率达到90%。

本发明所述的一种固相介质选择性提取短片段长度DNA的方法，包括如下步骤：

将通过表面修饰后具有表面电荷反转能力的固相介质加入到含片段长度小于200bpDNA的混合长度DNA溶液中，使溶液中固相介质的浓度为5mg/ml。利用氯化钠调节体系Na⁺浓度至0.1~0.5mol/L之间；调节混合溶液pH在3.0~5.5之间；将混合溶液摇床震荡30分钟后，采用离心分离的方式除去固相介质；向上清液中再加入固相介质，利用氯化钠调节体系Na⁺浓度至0.7~1.0mol/L之间，将混合溶液摇床震荡30分钟，采用离心分离方式，将吸附了DNA的固相介质和溶液分离；将离心分离的固相介质加入水中，调节pH在10.0~11.0之间，摇床震荡30分钟，采用离心分离的方式除去固相介质，获得含片段长度小于200bp的DNA溶液。

所述的固相提取介质，可以为表面修饰了赖氨酸的硅藻土、玻璃珠、无定型二氧化硅微粒、介孔二氧化硅微粒、无定型氧化硅包覆磁性微粒或介孔氧化硅包覆磁性微粒的任意一种。

所述的含片段长度小于200bpDNA的混合长度DNA溶液，其包含的其他DNA分子片段长度要大于400bp；所述方法适用的DNA混合溶液不包括仅包含200bp以下DNA与200-400bpDNA的混合溶液。

本发明的积极效果在于：

将利用硅烷偶联试剂在表面同时修饰氨基和羧基的固相介质和不同片段长度的DNA分子混合。通过对固相介质进行表面修饰，使介质随着pH值的变化具备电荷反转特性，通过加入一定浓度的盐溶液使得不同片段DNA具有的电荷量不同，从而通过静电相互作用选择性吸附特定长度片段的DNA分子，达到高效提取，选择性提取的目的。本发明的优点在于：对DNA具有高的吸附效率和脱附效率,总提取效率高于95%，对短片段DNA分子，选择性分离效率高于90%，所用试剂简单经济,操作快速便捷。

附图说明

图1为DNA琼脂糖凝胶电泳图；

图中，1道为marker，2道为混合DNA，3道为提取后DNA，4道为提取后残留DNA。

具体实施方式：

借助以下实施例对本发明做进一步描述，应理解，以下实施例是示范性的，而不是限制性的，可根据上述发明的技术方案和实际情况，来确定具体的实施方法。