[发明专利]一种用于表皮细胞培养的无血清培养体系

说明书

本发明提供一种可用于表皮细胞培养的无血清培养体系，包括基础培养基，以及氨基酸1‑5mM、霍乱毒素0.01‑0.5μg/ml、促生长因子0.1‑100μg/ml、腺嘌呤100‑300μM、铁源1‑10μg/ml、三碘甲状腺原氨酸1‑5μM、以及钙盐。本发明提供的培养基成分中无血清添加，可以同时应用于有滋养层及无滋养层的培养，该方法提取的原代细胞数量大，活性高，在培养过程中表皮细胞贴壁率高、增殖快、分化率低，经过培养的细胞活性高，仍具备细胞原有的功能性。

技术领域

本发明涉及一种组织工程培养体系，尤其涉及一种用于表皮细胞培养的无血清培养体系。

背景技术

表皮细胞是位于皮肤最浅层的细胞，主要由表皮形成细胞和树突状细胞等种类的细胞组成。其中，表皮祖细胞存在于表皮基底层及毛囊中。表皮细胞在很多情况下有很重要的作用，如组织工程皮肤的构建中可将表皮祖细胞导入来培养组织工程皮肤的表皮部分，皮肤病的病理研究与治疗中可借用体外培养的表皮细胞来帮助进行皮肤相关疾病的发病机理的研究并通过表皮细胞对药物的反应，进行创伤修复、基因治疗，此外，创伤处愈合效果与伤处的表皮细胞的数量与增殖活性等密切相关。因此，体外快速培养表皮细胞以供移植等方式在医学领域具有重要意义。

表皮细胞的体外培养早有历史，在20世纪70年代开始就已经有学者致力于表皮细胞的分离和培养。表皮细胞培养体系根据有无滋养层及有无血清添加而分为不同类型，如中国专利CN104548209A公开的表皮细胞制备方法，蛋白酶消化分离后，将细胞置于含胎牛血清的DMEM培养基中进行传代和培养，中国专利CN1431299A公开了一种含牛血清蛋白、过氧化氢酶的无血清IMDM培养基，CN101333513B公开了一种无血清培养基，可用于单细胞或低密度水平下生长代谢和形成良好的细胞群落。

其中，因现今血清仍存在未知成分，且属于异源添加物，因而有血清的培养体系一直存在争议，无血清培养虽然获得了一定程度的研究成果，但是一般难以达到有血清培养的生长速度。

发明内容

针对目前有血清培养体系存在的问题，本发明提供了一种无血清培养体系，可以同时应用于有滋养层及无滋养层的培养。

本发明第一个方面是提供一种可用于表皮细胞培养的无血清培养体系，所述无血清培养基包括基础培养基，以及

氨基酸1-5mM，优选为1.5-4mM，更优选为2-3mM；

霍乱毒素0.01-0.5μg/ml，优选为0.05-0.4μg/ml，更优选为0.8-0.3μg/ml，更优选为0.1-0.2μg/ml；

促生长因子0.1-100μg/ml，优选为0.2-90μg/ml，更优选为0.3-80μg/ml，更优选为0.4-60μg/ml，更优选0.5-50μg/m；

腺嘌呤100-300μM，优选为130-250μM，更优选为150-220μM，更优选为180-200μM；

铁源1-10μg/ml，优选为2-8μg/ml，更优选为3-7μg/ml，更优选为5-6μg/ml；三碘甲状腺原氨酸1-5μM，优选为1.5-4μM，更优选为2-3μM；

以及钙盐0.05-2mM，更优选为0.08-1.5mM，更优选为0.1-1mM，更优选为0.4-0.8mM。

其中，所述基础培养基可以是已知的可用于表皮细胞培养的合成培养基或商品化培养基中的一种或几种的混合物，如DMEM培养基、DMEM与Ham’s F12混合培养基、RPI1640培养基，以及商品化的EX-302(JRH公司)、EX-620(JRH公司)、SFM4(hyclone公司)培养基。

在一种优选实施例中，所述DMEM与Ham’s F12混合培养基中，DMEM与Ham’s F12重量比例优选为(0.5-10)︰1，更优选为(1-8)︰1，更优选为(2-6)︰1，更优选为(3-5)︰1。