[发明专利]用于多重PCR检测转基因作物的DPO引物组合及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种用于多重PCR检测转基因作物的DPO引物组合及检测方法。

背景技术

多重PCR技术被广泛应用于转基因检测中，然而多重PCR使用的普通引物容易形成引物二聚体，且引物之间易存在竞争，这导致多重PCR的稳定性不佳。另外，多重PCR的产物分析主要依靠琼脂糖凝胶电泳，分辨率较低，操作费时。DPO(Dualprimingoligonucleotide)引物技术的主要原理为：其引物包含两个各自独立的特异性引物区域，5′端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3′端序列包含6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄嘌呤(Inosine,I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5′和3′区域形两个独立功能的双特异性引物结构，研究表明5′和3′引物区域中有任何3个及以上碱基的错配，PCR反应将不能进行。DPO引物由于其特殊的结构，引物自身以及引物之间很少形成二级结构。该技术的优点主要在于它增强了多重PCR的稳定性，避免了传统引物在多重PCR反应中的引物之间形成二聚体，增强了引物的特异性，为多重PCR技术的应用提供了新的前景。另外，毛细管电泳技术的分辨率大大高于传统琼脂糖凝胶电泳，而且耗时短，为多重PCR产物的分析提供了新方法。

发明内容

本发明的目的是提供用于多重PCR检测转基因作物的DPO引物组合及检测方法。

为了实现本发明目的，本发明提供用于多重PCR检测转基因作物的DPO引物组合，所述DPO引物组合是以至少选自如下基因中的两种或两种以上的基因为靶基因设计的引物组合，所述基因为FMV35S、Cry1Ab、NPTII、NOS、CaMV35S、Pat和Bar；所述DPO引物组合如下：

FMV35S-F：5′-CAGTCCAAAGCCTCAACAAGGTCIIIIIACAGAGTC-3′；

FMV35S-R：5′-ATTAGTGAGTGGGCTGTCAGGACAIIIIITTTCCACG-3′；

Cry1Ab-F：5′-GGCCAGGGAGTGTACCGCAIIIIIAGCAGCAC-3′；

Cry1Ab-R：5′-GCTCACGCTGCTGTTGCTGAAIIIIITGCGGAAC-3′；

NPTII-F：5′-TCACCTTGCTCCTGCCGAGAAIIIIICCATCATG-3′；

NPTII-R：5′-GGGCATGCGCGCCTTGAIIIIIGCGAACAG-3′；

NOS-F：5′-CTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGIIIIIGCGATGATTATC-3′；

NOS-R：5′-AGGTTGCGCGCTATATTTTGTTTIIIIICGCGTATTAAATG-3′；

CaMV35S-F：5′-TCCTACAAATGCCATCATTGCGIIIIIGGAAAGGC-3′；

CaMV35S-R：5′-ATCACATCAATCCACTTGCTTTGAIIIIITGGTTGGA-3′；

Pat-F：5′-CTGATATGGCCGCGGTTTGTIIIIICGTTAACCA-3′；

Pat-R：5′-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAATIIIIICTTGTGGT-3′；

Bar-F：5′-GGTCTGCACCATCGTCAACCACIIIIICGAGACAA-3′；

Bar-R：5′-GACGAGGTCGTCCGTCCACTIIIIIGGTTCCT-3′；

其中，I为次黄嘌呤。

FMV35S-F和FMV35S-R为检测FMV35S基因的DPO引物，产物大小为365bp；Cry1Ab-F和Cry1Ab-R为检测Cry1Ab基因的DPO引物，产物大小为276bp；NPTII-F和NPTII-R为检测NPTII基因的DPO引物，产物大小为223bp；NOS-F和NOS-R为检测NOS基因的DPO引物，产物大小为182bp；CaMV35S-F和CaMV35S-R为检测CaMV35S基因的DPO引物，产物大小为153bp；Pat-F和Pat-R为检测Pat基因的DPO引物，产物大小为118bp；Bar-F和Bar-R为检测Bar基因的DPO引物，产物大小为94bp。