[发明专利]一种快速检测灰葡萄孢菌对SDHI类杀菌剂抗性的方法及引物组合物

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测灰葡萄孢菌对SDHI类杀菌剂抗性的方法及引物组合物，可用于灰葡萄孢菌对SDHI类杀菌剂抗性群体发展的动态监测与抗性风险评估，为作物灰霉病的抗性治理、流行预警及合理用药指导提供重要的理论依据。

背景技术

灰霉病是一类由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的植物真菌病害，可危害200多种蔬菜、果树以及观赏性植物等重要的经济作物，该病的发生可引起植物幼苗、果实及贮藏器官的猝倒、落叶、花腐、烂果及烂窑，造成严重的经济损失。近年来，随着保护地蔬菜生产的发展，加重了灰霉病的发生和流行。目前由于作物种质资源缺少高抗灰霉病的品种，采用化学药剂是控制灰霉病最有效方便的途径之一。多年来，灰霉病主要采用苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、嘧啶胺类、酰胺类、甲氧基丙烯酸酯类(QoIs)、琥珀酸脱氢酶抑制剂类(SDHI)等化学药剂进行防治，但随着使用年限的增长和使用剂量的增加，田间逐渐产生了抗药性群体，从而导致该病防效显著下降。灰葡萄孢菌对常用杀菌剂抗药性的监测不仅能应用于作物灰霉病的抗药性流行预警，而且也能为作物灰霉病的抗性治理提供用药指导。传统的杀菌剂抗性检测或监测的方法主要是通过分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴定是否为抗药性菌株，该方法检测周期较长，从分离到鉴定长达1周，甚至数周，且在病原菌培养过程中存在杂菌污染，给实验结果带来误差；同时，还需投入大量的人力资源，增加检测成本。近年来，随着核酸相关分子检测技术的发展，PCR技术为植物病原菌的抗药性检测提供了快速、灵敏、准确的优势，但是检测需要昂贵的实验仪器及繁琐的电泳过程，检测时间长，检测成本高昂等，不能满足经济高效检测的需求，并且在鉴定过程中还需要接触大量有毒有害试剂，对实验操作人员存在较大的安全隐患。因此，开发对植物病原菌抗药性检测的新技术已迫在眉睫。

环介导恒温扩增反应(LAMP)是2000年由日本学者Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是：利用一套(4种)特异性引物，在一种高活性链置换DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增出产物)时为紫色，阳性(有产物扩增)时为天蓝色。LAMP方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，极适于病原的快速诊断及抗性检测。

经过多年的研究发现灰葡萄孢菌对SDHI类杀菌剂的抗药性主要是由灰葡萄孢菌琥珀酸脱氢酶基因B亚基(SdhB)突变造成，该基因编码第225、230或272位氨基酸密码子的突变可引起灰葡萄孢菌对SDHI类杀菌剂抗药性的产生。225位氨基酸突变的基因型为P225Y(CCC→TTC)；230为氨基酸突变的基因型为N230I(AAC→ATC)；272位氨基酸的突变可分为3种突变基因型，分别为H272R(CAC→TAC)、H272Y(CAC→CGC)和H272L(CAC→CTC)。5种突变基因型P225Y、N230I、H272R、H272Y和H272L约占抗性突变类型的比例分别为5.26％、8.77％、68.42％、15.79％和1.75％。因此，在本发明中，依据灰葡萄孢菌琥珀酸脱氢酶基因B亚基(SdhB)272位氨基酸的3种突变基因型(H272R/H272Y/H272)，基于环介导恒温扩增技术(LAMP)建立了灰葡萄孢菌对SDHI类杀菌剂抗性的快速分子检测技术。该检测技术具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对灰霉病的有效防治、抗药性流行预警具有重要的现实意义。然而，经检索目前国内外尚未有灰葡萄孢菌对SDHI类杀菌剂抗药性菌株的LAMP快速分子检测的相关报道。

发明内容