[发明专利]一种基于比色分析的免疫传感器的制备方法及应用

权利要求书

1.一种基于比色分析的免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用质量分数为0.1%~10%的3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES的甲醇溶液浸泡3mm×3mm的ITO玻璃24h，取出后洗涤；

（2）在ITO玻璃上滴加6μL、3-氨丙基三甲氧基硅烷-戊二醛显色复合物APTMS-GA，4oC冰箱中晾干；

（3）继续滴加6μL、1μg/mL~100μg/mL的甲胎蛋白抗体Ab，4oC冰箱中晾干，超纯水冲洗，再于4oC冰箱中晾干；

（4）继续滴加6μL、质量分数为0.1%~2%的BSA溶液，封闭玻璃表面上非特异性活性位点，4oC冰箱中晾干；

（5）继续滴加6μL、0.0001ng/mL~50ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液到ITO玻璃上，超纯水冲洗，4oC冰箱中晾干；

（6）继续滴加6μL的抗体孵化物AbAuN-TiO₂GO_x溶液，4oC冰箱中晾干，超纯水洗涤，4oC冰箱中晾干；

（7）继续滴加6μL、1~100mmol/L的葡萄糖溶液，充分反应；

（8）将修饰好的ITO依次放入微孔板中，4oC冰箱中晾干，制得比色免疫传感器。

2.如权利要求1所述的一种基于比色分析的免疫传感器的制备方法，所述的抗体孵化物AbAuN-TiO₂GO_x溶液，制备步骤如下：

（1）金纳米粒子的制备

取1~3mL、质量分数为1%的HAuCl₄溶液，用高纯水稀释至100~200mL，磁力搅拌，沸腾后加入1~15mL、质量分数为1%的柠檬酸钠，煮沸至酒红色不再改变，继续加热5min，室温冷却，制得金纳米粒子；

（2）负载标记物的N-TiO₂材料的制备

向锥形瓶中加入30mL、质量分数为99.5%的乙醇溶液，继续加入0.1~1.0g尿素，搅拌；向试管中加入0.1~2.5g的酞酸丁酯Ti(OBu)₄，430μL、质量分数为37%的盐酸；待试管中溶液混合均匀后，将试管中的混合液缓慢加入到尿素溶液中，溶液变成乳白色，搅拌14h；将溶液转移到反应釜中，130oC条件下加热1~10h，反应釜冷却后，将固体用乙醇洗涤，离心2次，在烘箱中干燥4~10h，将干燥后的白色固体用研钵研磨成粉末，放入瓷舟内，在200~600oC灼烧2h，冷却后得到N-TiO₂材料；

（3）AuN-TiO₂复合材料的制备

取0.1~2gN-TiO₂材料加入50mL无水乙醇，加热到70oC，快速逐滴加入500μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，70oC反应3~10h，将得到的白色溶液离心，制得氨基化N-TiO₂，将氨基化N-TiO₂与AuNPs混合并离心，直至所加Au纳米溶胶不再变色；将固体干燥，研磨，制得AuN-TiO₂复合材料；

（4）抗体孵化物AbAuN-TiO₂GO_x溶液的制备

将1~5mg的AuN-TiO₂加入到2mL水中，并加入400μL、1μg/mL~100μg/mL的甲胎蛋白抗体Ab溶液和0.1~5mg的葡萄糖氧化酶GO_x，充分混匀，震荡24h，制得抗体孵化物AbAuN-TiO₂GO_x溶液。

3.如权利要求1所述的一种基于比色分析的免疫传感器的制备方法，所述的显色复合物APTMS-GA，其特征在于，制备步骤如下：

将质量分数为0.5%~10%的3-氨丙基三甲氧基硅烷APTMS和质量分数为0.2%~5%的戊二醛GA按照1:1比例进行混合，制得砖红色的APTMS-GA标记物。

4.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于比色分析的化学免疫传感器用于甲胎蛋白的检测，步骤如下：

待微孔板中的ITO显色板在室温下充分反应后，在相同的光照强度下对每一块ITO拍照，用ImageJ软件计算每一块玻璃的灰度，得到平均灰度与抗原浓度曲线；按照工作曲线的方法对样品进行测定，依据工作曲线计算甲胎蛋白含量。