[发明专利]编码杀虫蛋白的核苷酸序列及其应用

说明书

本申请涉及改造的抗鳞翅目害虫新基因及其在植物育种中的应用。并设计构建了稳定高效表达该基因的转化载体；将该基因转化到玉米自交系中，获得转基因抗虫玉米。通过鳞翅目害虫进行杀虫活性生物测定对照实验，验证了改造后的基因较其他同类基因的抗虫性具有明显提升。

技术领域

本申请涉及植物基因工程及作物育种技术领域。具体地说，本申请涉及改造抗鳞翅目害虫的新基因及其应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)可以分泌毒蛋白，对鳞翅目、鞘翅目昆虫(比如小菜蛾)有很强的杀伤作用。人类很早就研究利用Bt菌来杀灭害虫，迄今有100多年的历史。随着分子生物学技术的发展和基因克隆、DNA操作等技术的出现，人类开始从Bt菌中克隆其毒蛋白基因到工程菌中，制作生物农药。

Bt毒素主要分为内毒素和外毒素。外毒素指细菌在生命活动过程中排出体外的代谢物，包括α-外毒素、β-外毒素、γ-外毒素、不稳定外毒素和水溶性外毒素等。内毒素又称δ-内毒素、晶体毒素或杀虫晶体蛋白伴胞晶体，由一种或多种杀虫晶体蛋白组成。内毒素在Bt对昆虫的致死过程中起主要作用。本申请涉及的cry1Ca基因编码的杀虫蛋白属于内毒素，即杀虫晶体蛋白。

许多Bt杀虫晶体蛋白的氨基酸序列存在不同程度的同源性。1989年，Hofte和Whiteley根据Bt杀虫晶体蛋白的杀虫谱和氨基酸序列的同源性，将当时发现的42个Bt基因分为五大类、十四个亚类(Hofte H and Whiteley HR，Microbio.Rev.,53:241-255)。其中，前四大类为晶体蛋白的基因家族cry，第五类为细胞溶解蛋白基因cyt。cry基因可划分为四群，即cryI为鳞翅目特异性，cryⅡ为鳞翅目和双翅目特异性，cryⅢ为鞘翅目特异性，cryIV为双翅目特异性。由于当时发现的基因数目少，彼此之间有明显的差异，因此各个基因的分类地位比较明确，从而使得Hofte和Whiteley的分类系统被广泛地接受和采用。本申请涉及的基因cry1C适用这个分类系统，属于鳞翅目特异性杀虫基因。

近年来，不断发现的杀虫晶体蛋白及其基因使得原先分类系统中的氨基酸序列与杀虫活性间产生了不协调性，而且随着新基因的发现，这种分类方法越来越不能满足这两个条件，使得分类难以确定。Crickmore等在1995年国际无脊椎动物病理学会年会(SIP)上提出了以杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性为唯一依据区别Bt基因的新分类系统，现已被各国广泛采纳。具体来说，杀虫晶体蛋白氨基酸同源性在45％以下，为第一等级，用阿拉伯数字表示；同源性在45％～78％之间，为第二等级，用大写英文字母表示；同源性在78％～95％之间，为第三等级，用小写英文字母表示；同源性在95％以上，为第四等级，用阿拉伯数字表示。例如本申请涉及的cry1Ca5为第四等级。

Obukowics等学者在1986年将cryIA(b)基因经转座子Tn5介导引入到植物的假单孢杆菌中，使植物具有抗虫性，从而创造了第一代Bt转基因抗虫植物，这也是Bt毒蛋白基因使植物获得抗虫性的最早报道。真正的Bt毒蛋白转基因植物是第二代Bt抗虫植物，第一个成功的例子是由比利时的植物遗传系统公司在1987年6月报道的(Vaeck等，Nature，328:33-37，1987)，他们用农杆菌介导法成功地将完整的cryIA(b)基因和3’、5’端缺失后只保留5’端编码毒蛋白核心区的不同长度的cryIA(b)基因导入烟草获得了抗烟草天蛾的转基因烟草植株。

发明内容

在一方面，本申请提供了分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含SEQ IDNO:1所示核苷酸序列，或其互补序列。本申请还提供了与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的序列。在一实施方案中，本申请提供了与该基因具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列。在一实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。在一实施方案中，所述核酸分子由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列组成。