[发明专利]用于扩增襀翅目昆虫线粒体COI基因的特异性引物

说明书

技术领域

本发明涉及一对用于扩增襀翅目昆虫线粒体细胞色素c氧化酶I(cytochrome c oxidase I；COI)基因的特异性引物。

背景技术

襀翅目(Plecoptera)又称石蝇，该类昆虫在除南极以外的世界各大陆上均有分布，但主要分布于东洋区、古北区及新北区，尤以横跨古北和东洋两大动物地理区的我国种类最为丰富。襀翅目昆虫较广泛地分布在多种类型的水域中，是重要的水质监测指标生物，加强该类群的分类研究，可以更好地为水质环境监测提供服务。

从系统学和进化学的角度来看，襀翅目是一个关键的类群。虽然襀翅目系统发育被广泛研究，但仍需要通过其他更多的特征来证明。而通过分子手段获得的资料将更有助于推断襀翅目各科间的亲缘关系以及和其他目的亲缘关系。我国有关襀翅目原颚类昆虫的研究仅限于传统形态学，分子学研究目前仍是空白。深入了解襀翅目昆虫的起源、进化和系统发育关系，对重建襀翅目系统发育乃至研究昆虫纲的进化关系都具有重要意义。这就需要借助快速而准确的分子手段对襀翅目昆虫进行相关领域的研究。

近年来，利用分子技术对物种进行分类和系统发育分析已成为一种普遍而且有效的方法，其中线粒体COI基因由于具有较高的进化速率已成为区分物种和研究物种进化关系的一种理想基因。因此，利用COI基因对襀翅目昆虫进行物种鉴定和系统发育分析是一种较好的方法，目前，昆虫遗传研究过程中，扩增昆虫线粒体COI基因一般是采用已报道的通用引物，但由于其通用性较强，特异性较弱，在实际研究过程中，扩增昆虫COI基因的同时，也往往能扩增出昆虫体表及体内杂菌的COI基因片段且扩增片段长度较短。这将导致某些昆虫，如对襀翅目昆虫的系统发育研究的作用不理想，琼脂糖凝胶电泳检测的条带往往为双条带甚至多条带，测序峰图多为双峰。这给对襀翅目昆虫进行大规模的系统发育进化研究分析带来了阻碍。目前国际上没有专门针对扩增襀翅目昆虫COI基因的特异性引物的相关报道。

发明内容

本发明目的是提供一种襀翅目昆虫线粒体COI基因扩增的特异性引物，它能满足现有技术的上述需求。

一对用于襀翅目昆虫线粒体COI基因序列扩增的引物，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明还公开了一种襀翅目昆虫线粒体COI基因序列扩增方法，是采用上述的引物，用50μl PCR体系在特定PCR扩增条件下进行目标片段扩增。

所述的50μl PCR体系是：5μl 10×buffer(+Mg²⁺)，2.5μl dNTP(2.5mM)，3μl引物LeCOI-F(10μM)，3μl引物LeCOI-R(10μM)，0.5μl rTaq酶(5μ/μl)，2μl DNA模板(100ng)，34μl双蒸水。

所述的PCR扩增条件是：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟15秒，51℃退火温度1分钟15秒，72℃延伸1分钟5秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。

本发明根据襀翅目COI基因序列较保守和非特异性扩增引物扩增效率低的特性，通过比对襀翅目不同科物种的COI基因序列设计出扩增引物。采用本发明的襀翅目线粒体COI基因的扩增引物，可以有效地扩增出襀翅目不同科物种的COI基因序列，填补了襀翅目COI基因没有专门的扩增引物的空白，对襀翅目不同科和属的昆虫进行大规模的COI测序，准确鉴定某些形态上难于鉴别的近缘物种，为我国襀翅目昆虫的分类鉴定、系统发育、种群遗传结构和地理种群鉴别提供了重要工具。本发明涉及的扩增引物较过去通用引物有较大的优势，具体表现为：本引物能有效扩增出近2000bp的COI基因片段，完全覆盖COI基因全长，而过去通用引物有效扩增长度一般为500-800bp，且扩增片段大多为保守区域，不利于上述研究的数据分析。利用本引物对襀翅目昆虫进行大规模的系统发育进化分析，能显著降低实验成本，缩短实验周期，提高实验的准确性。

附图说明

图1是本发明引物对襀翅目9科昆虫COI基因的扩增效果图。1为卷襀；2为钮襀；3为扣襀；4为钩襀；5为襟襀；6为新襀；7为刺襀；8为网襀；9为绿襀。

图2是通用引物对襀翅目9科昆虫COI基因扩增效果图。1为卷襀；2为钮襀；3为扣襀；4为钩襀；5为襟襀；6为新襀；7为刺襀；8为网襀；9为绿襀。

具体实施方式