[发明专利]一种鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种鸡胚肺动脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

分离鸡胚人字形肺动脉血管并用PBS保证其湿润，修剪去除血管周围细小的结缔组织，将人字形血管分离为两根血管后分别对两根血管进行两次纵切，用胰蛋白酶溶液将纵切后的血管在37℃消化1-2min后用完全培养基终止消化获得消化后的组织块，将消化后的组织块切割成尺寸为0.4-0.6mm的组织小块，将组织小块在完全培养基中进行原代培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将组织小块在完全培养基中原代培养的条件包括，按照0.8-1.2mm间距将组织小块平铺在含有完全培养基的培养皿内进行原代培养。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在原代培养第3天进行补液；以及，在原代培养第4天挑出培养皿内的组织块并更换培养皿中的完全培养基继续原代培养。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在原代培养第5天进行传代培养，所述传代培养的条件包括：用浓度为0.08-0.085％的胰蛋白酶溶液在37℃下消化3-5分钟后添加传代完全培养基终止消化，调整细胞悬液的密度至2.0×10⁵个/ml后接种于培养皿中。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，原代培养中所使用的完全培养基为含有20％FBS和0.5‰抗坏血酸的M199培养基；传代培养中所使用的传代完全培养基为含有10％FBS和0.5‰抗坏血酸的M199培养基。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于，用于消化纵切后的血管的胰蛋白酶溶液的浓度为0.25％。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，分离鸡胚人字形肺动脉血管的步骤包括：

将经过75％酒精喷洒消毒的鸡胚放置于超净台内，取用第一套镊子敲击鸡胚钝端气室，镊子小心卡住鸡胚颈部取出鸡胚，用第一套剪刀剪断鸡胚未吸收部分；取用第二套剪刀镊子剪开鸡胚胸腔，防止羽毛黏附于内脏，擦拭剪刀镊子；用第三套镊子夹住心尖，向上提起露出心脏腹面，剪刀小心剥离白色血管周围的结缔组织，并斜向下方向沿着血管根部剪断，保证人字形肺动脉血管的长度，取下放置于盛有PBS的培养皿内。

8.根据权利要求1-5和7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述鸡胚的胚龄为16-17天。