[发明专利]来自海洋的芽孢杆菌ZE01及其产低温淀粉酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物，特别是一种分离自中国江苏省连云港海域海泥的芽孢杆菌（Bacillus sp.）ZE01；本发明还涉及该菌株产低温淀粉酶的方法。

背景技术

α-淀粉酶(EC3.2.1.1)是指一类作用于淀粉分子，从分子内部切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖的水解酶，产物末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故称α-淀粉酶。淀粉酶广泛应用于食品、医药、洗涤、造纸、纺织及皮革等领域。低温淀粉酶一般来源于低温微生物，通常情况下，在相对较低温度范围内，低温淀粉酶的活性比相应的嗜温淀粉酶要高。目前研究的淀粉酶主要是中高温淀粉酶，这些酶只有在较高温度下才具有较好的催化活性，因而耗费能量巨大，如果采用低温淀粉酶则可以节约能量，降低生产成本，符合我国国情，研究前景广阔，逐渐成为人们研究开发的热点。因此从海洋环境中筛选高产低温α-淀粉酶的菌株，是今后研究和开发低温淀粉酶的关键。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产低温淀粉酶的来自海洋的芽孢杆菌ZE01。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述芽孢杆菌ZE01产低温淀粉酶的方法。

本发明的特征包括来自海洋的芽孢杆菌（Bacillus sp.）ZE01菌株本身（以下称菌株ZE01），以及利用该菌株发酵生产低温淀粉酶的方法。

本发明所涉及的菌株ZE01是在中国江苏省连云港海域的海泥中分离到的芽孢杆菌（Bacillus sp.）ZE01，该菌株已于2015年1月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.10375。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话：010-64807355。

以下对本发明进行详细的阐述。

一、本发明菌株ZE01的形态特征与生理生化特征。

1.1形态特征：

菌株ZE01为革兰氏阳性芽孢杆菌(见图1)；在2216E固体培养基中培养24h后，菌落呈乳白色，表面干燥，有皱褶。在淀粉筛选培养基培养48h后,加碘液后能产生明显的透明圈 (见图2)。

1.2生理生化特征:

该菌株VP、明胶酶实验、葡萄糖氧化实验呈阳性，β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱氨酶、脲酶实验呈阴性，不利用柠檬酸，不产生硫化氢和吲哚，不利用蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蜜二糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、苦杏仁苷，生理生化结果见表1。

表1 菌株ZE01的生理生化特征

注: +: 阳性; −: 阴性

1.3菌株ZE01的序列的扩增和分析：

用Generay试剂盒提取得到ZE01的基因组，选用扩增原核微生物16S rDNA序列的通用引物（27F :5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）于PCR mix体系中反应。反应体系：PCR mix（46μL），上下游引物（各1μL），DNA模板（2μL）。反应程序：94 ℃变性5 min； 94 ℃变性30 S，54 ℃退火30 S，72 ℃延伸90 S，32个循环；72 ℃ 10 min。将PCR电泳纯化回收并构建克隆载体，选阳性克隆子提取质粒送至南京思普金生物科技有限公司测序，将测得序列互补反相拼接后，获得的1262bp碱基片段序列，用MEGA5软件进行16S rDNA序列的比对分析，并构建系统发育树（如图3），将该序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，结果发现与芽孢杆菌属（Bacillus）最接近。

二、本发明菌株ZE01的生长特性

本发明提供的菌株ZE01，对其生长特性进行了细致的研究，基本摸清不同条件下该菌的生长情况。

2.1本发明中涉及的培养基：

2216E培养基：蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，陈海水配制，pH8；

淀粉筛选培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，可溶性淀粉0.2%，陈海水配制，pH8.0；

产酶培养基：甘油0.5%，玉米淀粉0.5% 氯化铵0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0。

2.2种子液的制备：将菌株ZE01斜面种子接种到2216E培养基中, 30℃, 180 r/min, 装液量20%, 培养16 h。

2.3培养时间对菌株ZE01生长的影响：