[发明专利]S100A9重组腺病毒、其构建及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组腺病毒，具体涉及一种S100A9重组腺病毒、其构建及应用。

背景技术

在严重危害女性健康的恶性肿瘤中，宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，位于第二。据全球范围统计，宫颈癌每年的新发病例大约有50万，其中发展中国家占80%以上。且近年宫颈癌的发病有年轻化趋势。大量的研究表明，高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是宫颈癌发病的首要因素，但大多数HPV感染的女性并未发展为宫颈癌。说明宫颈癌的发生发展是一个多因素、多步骤、多基因参与的过程，但具体的发生发展机制还尚未明确。故深入探讨宫颈癌发生发展的机制，将为宫颈癌的治疗提供新的思路和实验依据。C33A细胞是人宫颈鳞癌细胞系，是宫颈癌研究常用的细胞系。

S100属于钙结合蛋白家族，是一类只在脊柱动物中发现的小分子酸性蛋白。S100A9为其中一个成员，常与S100A8结合形成异二聚体。通过与第二信使之一Ca²⁺结合，以及与靶蛋白的相互作用，参与多种生物学功能，如细胞的分化、增殖、黏附、迁移和信号转导等。S100A9位于1号染色体长臂2区1带（1q21），该区段稳定性差，容易发生染色体缺失、重排、易位或重叠等，故推测其可能参与肿瘤的发生发展。近年来研究表明，S100A9在多种恶性肿瘤中表达上调，如口腔舌癌、未分化的甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌和卵巢癌等。

在前期研究中，采用免疫组织化学的方法，发现S100A9在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变、宫颈鳞癌中的表达逐渐增高，但S100A9在宫颈癌发生发展中的具体机制尚缺乏客观的依据。

前期的研究中，比较分析C33A，MS751，SiHa，CaSki等宫颈鳞癌细胞系中S100A9mRNA和S100A9蛋白的表达，发现S100A9mRNA和S100A9蛋白均在C33A宫颈鳞癌细胞系中的表达最低，所以本发明选择宫颈鳞癌C33A细胞作为进一步研究S100A9重组腺病毒转染细胞使S100A9高表达对细胞生物学行为影响的细胞。

发明内容

本发明通过重组腺病毒技术，构建宫颈鳞癌C33A细胞的S100A9重组腺病毒，探讨S100A9对宫颈鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。

本发明提供了一种S100A9重组腺病毒载体质粒，将S100A9蛋白编码基因重组至pHBAd-MCMV-RFP载体得到所述S100A9重组腺病毒载体质粒，所述S100A9蛋白编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，上述的S100A9重组腺病毒载体质粒由经Not I和Nsi I双酶切的pHBAd-MCMV-RFP载体与S100A9蛋白编码基因连接、转化后构建而成。

本发明提供上述的S100A9重组腺病毒载体质粒的构建方法，包括如下步骤：

（1）设计引物

S100A9蛋白编码基因的引物如下：

S100A9-NotI-F:ACACGCGGCCGCATGACTTGCAAAATGT；

S100A9-NsiI-R:ACACGATGCATTTAGGGGGTGCCCT；

（2）以含有S100A9蛋白编码基因的RNA逆转录后为模板，用所述引物和DNA聚合酶进行聚合酶链式反应扩增，纯化，得到扩增产物；

（3）pHBAd-MCMV-RFP载体扩增和双酶切

将pHBAd-MCMV-RFP载体用Not I和NsiI双酶切，酶切完成后，胶回收纯化；

（4）将步骤2）得到的扩增产物和步骤3）经过双酶切的载体进行连接、转化、提取，即可得到重组腺病毒载体质粒pHBAd-MCMV-RFP- S100A9。

优选地，步骤4）中的转化包括如下步骤：步骤2）得到的扩增产物和步骤3）经过双酶切的载体进行连接后得到的连接产物中加入感受态细胞，冰上孵育20-30min，40~45℃下水浴60~120sec，于冰上速冷2-3min，加入LB培养基，35~40℃振荡温育，离心，取重悬沉淀，混匀后取适量均匀涂于平板，置于37℃培养箱中倒置培养；在LB培养基中加入氨苄青霉素构成培养基，取平板上培养得到的单克隆接种到所述培养基中，37℃培养箱中，振荡。

进一步优选地，所述感受态细胞为DH5α感受态细胞。

本发明还提供一种S100A9重组腺病毒，其上述的S100A9重组腺病毒载体质粒和骨架质粒转染HEK293细胞得到重组腺病毒Ad-S100A9。