[发明专利]同时检测空肠弯曲菌三种血清型的试剂盒

说明书

本发明提供了同时检测空肠弯曲菌三种血清型的试剂盒，属于多重PCR检测技术领域。本发明试剂盒含有三对分别针对空肠弯曲菌血清型HS:41、HS:19、HS:2的特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑2，SEQ ID NO.3‑4，SEQ ID NO.5‑6所示。本发明还提供了用于检测空肠弯曲菌上述三种血清型的特异性靶序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、8、9所示。本发明基于空肠弯曲菌各血清型的特异序列建立多重PCR检测试剂盒对空肠弯曲菌上述三种血清型检测灵敏度、特异度均为100％，具有检测准确，节约成本，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。

技术领域

本发明涉及PCR检测技术领域，特别是涉及用于检测空肠弯曲菌血清型HS:41、HS:19、HS:2的特异性引物对组合和三重PCR检测方法，本发明还涉及同时检测空肠弯曲菌三种血清型的试剂盒。

背景技术

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是弯曲菌属中主要导致人类疾病的食源性病原菌，是导致人类腹泻的主要病原之一。空肠弯曲菌分布广泛，人类感染主要是由于空肠弯曲菌污染食品、饮用水以及环境引起的，除肠炎外，空肠弯曲菌的感染可导致格林-巴利综合症(Guillian-Barre syndrome，简称GBS)，给人类带来严重的疾病负担。国内外对空肠弯曲菌的监测都非常关注。

空肠弯曲菌感染后导致GBS的机率不大，但特异菌型菌株，如血清型(Pennerheat-stable serotype，HS)为HS:41，HS:19，HS:2的菌株感染后导致GBS的危险度大大增高。血清型为HS:41菌株的感染，曾经导致我国36人GBS的暴发。对于这种感染后可导致严重疾病后果的空肠弯曲菌血清型的鉴别确定有利于疾病防控和保障公共卫生安全。

目前空肠弯曲菌的血清型鉴定试剂匮乏、昂贵，实验步骤繁琐，需要有经验的专业人员操作，造成空肠弯曲菌血清分型的困难。因此迫切需要一种快速、准确、特异、灵敏地检测空肠弯曲菌血清型HS:41，HS:19，HS：2的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供用于同时检测空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)三种血清型HS:41，HS:19，HS：2的特异性引物对组合。

本发明的另一个目的在于提供能够同时检测空肠弯曲菌HS:41，HS:19，HS：2血清型的试剂盒。

为实现上述目的，本发明通过对决定菌株血清型的荚膜多糖(polysaccharidecapsule，简称CPS)合成相关基因簇的特异核苷酸序列的检测确定弯曲菌的血清型特征。对HS:41，HS:19，HS：2三种血清型空肠弯曲菌分别找出其共同的CPS合成基因簇相关DNA序列，以及区别于其它血清型的特异DNA序列，在NCBI上进行BLAST比对，确定筛选出这些序列针对上述三种血清型菌株的共同性以及特异性。通过比对，获得HS:41，HS:19，HS：2三种血清型菌株共有而其它血清型菌株中不存在的三段特异序列：HS:41血清型菌株特异性序列命名为SE-HS41-3,HS：19血清型菌株特异序列命名为SE-HS19-1，HS：2血清型菌株特异序列命名为SE-HS2-4，具体核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-9所示。

Vector NTI Suite 6比对已测序HS：41，HS:19，HS：2的CPS相关基因的特异序列一的保守性。并用primer premier 5设计引物，引物设计避开序列的突变点，同时要考虑所设计的三对引物之间以及引物与靶序列之间不错配，不出现二级结构，并且三对引物扩增的目的片段的长度具有区别度，大小不能太接近。

经过反复验证对比，最终确定用于检测空肠弯曲菌三种血清型的特异性引物对组合，分别为：

用于检测血清型HS:41的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1、2所示；