[发明专利]新的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体和制备熊去氧胆酸的方法

权利要求书

1.7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)突变体，所述突变体至少催化7-酮类固醇立体特异性酶促还原至对应的7-羟基类固醇，其中突变体较之非突变的酶，具有特别是对7-酮类固醇底物的降低的底物抑制，和/或改变的辅因子利用。

2.如权利要求1中要求保护的突变体，其中所述突变体在根据SEQIDNO：2的氨基酸序列或从其衍生的具有至少60％序列同一性的氨基酸序列中有至少一个突变。

3.7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)突变体，所述突变体至少催化7-酮类固醇立体特异性酶促还原至对应的7-羟基类固醇，其中所述突变体在根据SEQIDNO：2的第36至42位的序列基序VMVGRRE中或从其衍生的具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的对应的序列基序中有至少一个突变。

4.如权利要求2或3中要求保护的突变体，所述突变体选自

a)单突变体G39X₁和R40X₂

b)双突变体(G39X₁，R40X₂)，(R40X₂，R41X₃)和(G39X₁，R41X₃)或

c)三突变体(G39X₁，R40X₂，R41X₃)，

d)或从SEQIDNO：2衍生的具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的对应的单、双或三突变体；

其中在每种情况下X₁，X₂和X₃彼此独立地代表突变的氨基酸残基。

5.重组微生物，其携带编码如前述权利要求之一中要求保护的突变体的至少一种核酸序列或至少一种对应的表达盒或至少一种对应的载体并另外任选地携带另一种酶的编码序列，所述另一种酶选自羟基类固醇脱氢酶，例如3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSDH)，和适于辅因子再生的脱氢酶。

6.用于7β-羟基类固醇的酶促或微生物合成的方法，其中在存在根据权利要求1至4之一中定义的7β-HSDH突变体时或在存在表达此突变体的重组微生物时，使对应的7-酮类固醇起反应，且任选地从反应混合物中分离形成的至少一种还原产物。

7.如权利要求6中要求保护的方法，其中所述还原在存在和特别是消耗NADPH和/或NADH时进行。

8.如权利要求7中要求保护的方法，其中通过与NADPH再生酶偶联再生用过的NADPH，其中所述NADPH再生酶特别选自NADPH脱氢酶、醇脱氢酶(ADH)、和NADPH再生甲酸脱氢酶(FDH)和NADPH再生葡萄糖脱氢酶(GDH)，其中所述NADPH再生酶任选地通过重组微生物表达；和/或其中通过与NADH再生酶偶联再生用过的NADH，其中所述NADH再生酶特别选自NADH脱氢酶、NADH再生甲酸脱氢酶(FDH)、NADH再生醇脱氢酶(ADH)、NADH再生葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(G6PDH)、NADH再生亚磷酸盐脱氢酶(PtDH)和NADH再生葡萄糖脱氢酶(GDH)，其中所述NADH再生酶任选地在重组微生物中表达。

9.如权利要求8中要求保护的方法，其中所述NADPH再生酶选自NAD⁺依赖性甲酸脱氢酶(FDH)(其至少催化甲酸酶促氧化至CO₂)的突变体，其中所述突变体较之非突变的酶，额外地接受NADP⁺作为辅因子。

10.如权利要求9中要求保护的方法，其中所述NADP⁺接受FDH突变体在根据SEQIDNO：36的来自母牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae)N10的FDH的氨基酸序列或从其衍生的具有至少60％序列同一性的氨基酸序列中有至少一个突变。

11.如权利要求9和10之一中要求保护的方法，其中所述NADP⁺接受突变体在根据SEQIDNO：36的第221至226位的序列基序TDRHRL中或在从其衍生的具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的对应序列基序中有至少一个突变。