[发明专利]固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备方法及其应用

权利要求书

1.固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）将一定摩尔比例的可溶性Fe²⁺和Fe³⁺盐溶解在纯水溶液中，向其中加入表面活性剂，并通氮气30min，反应在超声波体系（F=28KHz）中进行；之后将温度升高到40～70℃，在超声波分散状态（F=28KHz）下缓慢滴加碱液到反应体系中,最终使pH值达到10～11，反应30min后继续向体系中加入一定量的浓度为1%的壳聚糖季铵盐溶液，之后将温度升高到80℃反应1～6h，终止反应，之后在外加磁场的作用下分离磁性颗粒，并且用去离子水清洗数次至中性，对收集到的磁性颗粒进行干燥处理，即可得壳聚糖季铵盐磁性纳米颗粒粉末，简写为MNPs；

（2）配制一定浓度的FeCl₃·6H₂O溶液，加入准确称重的MNPs，在室温下振荡吸附2h，使Fe³⁺与磁性MNP表面基团分子充分反应完全，即可得固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒（MNPs@Fe³⁺）。

2.根据权利要求1所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于其中所述的可溶性的Fe²⁺化合物是四水氯化亚铁或七水硫酸亚铁；可溶性的Fe³⁺化合物是六水氯化铁；其中Fe²⁺与Fe³⁺的摩尔比为1:2～2:1，总铁离子浓度为0.03～0.5M。

3.根据权利要求1所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于其中所述的碱液为氨水或氢氧化钠或两者的混合物。

4.根据权利要求1所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于其中所述的表面活性剂为聚乙二醇6000，十二烷基苯磺酸钠和十六烷基三甲基溴化铵中的任何一种。

5.根据权利要求1所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒用于富集PPPs的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）PPPs吸附原液的制备

A、新鲜鸡蛋进行蛋清和蛋黄的分离，将蛋黄置于滤纸上除去附着的蛋清，用针挑破膜，收集蛋黄内容物，之后进行喷雾干燥，得蛋黄粉；蛋黄粉经95%乙醇脱脂处理（脱脂率95.2%），之后于60℃烘干，并保存于干燥环境中；

B、脱磷、酶解：称取脱脂蛋黄粉于0.1M的NaOH溶液中,于37℃下反应3h，反应结束后迅速用0.1M盐酸将pH调节至8.0；

用去离子水稀释3～5倍，之后用3000K超滤膜进行超滤处理，并将超滤后的滤液转移到酶解反应器里，加入胰蛋白酶(底物:酶量=10:1)，pH8.0，50℃下酶解4h，并用0.1MNaOH调节pH，使酶解液的pH维持在8.0；

水解结束后于80℃下灭酶10min，待冷却至室温，调节pH至4.5，酶解液于9000r/min4℃下离心10min，取上清液，此上清液作为PPPs的吸附原液，测N、P含量，计算N/P；

（2）PPPs的富集

将MNPs@Fe³⁺磁性纳米颗粒加入到含有PPPs的吸附原液中，在一定温度下搅拌反应一定时间，使溶液中的PPPs特定地吸附在MNPs@Fe³⁺磁性纳米颗粒表面，在外加磁场的作用下将吸附有PPPs的磁性纳米颗粒从反应溶液中分离出来，用去离子水清洗三次去除杂质，再用洗脱液进行洗脱，收集PPPs的洗脱液，测N、P含量，计算N/P，最后冷冻干燥得到卵黄高磷蛋白磷酸肽。

6.根据权利要求5所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒用于富集PPPs的方法，其特征在于其中所述的步骤（2）富集过程中选用的温度为15～45℃。

7.根据权利要求5所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒用于富集PPPs的方法，其特征在于其中所述的步骤（2）富集反应时间为30～240min。

8.根据权利要求5所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒用于富集PPPs的方法，其特征在于其中所述的步骤（2）富集过程中富集后选用的洗脱液为体积百分比5～15%的氨水溶液（pH=10.5）。

9.根据权利要求5所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒用于富集PPPs的方法，其特征在于其中所述的步骤（2）中PPPs吸附原液中蛋白质含量为1～20mg/mL，缓冲液的pH为4～8。