[发明专利]一种苹果酸酶基因RKME1及其重组表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种苹果酸酶（Malic enzyme）基因及其重组表达载体，具体涉及以红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235 cDNA为模板，扩增得到编码苹果酸酶（ME）的基因RKME1，将其连接至表达载体，进一步转化至大肠杆菌BL21中，诱导表达，镍柱亲和层析纯化重组蛋白，并对纯化后的蛋白进行了酶活测定。属于微生物基因工程和酶工程领域。

背景技术

苹果酸酶（malic enzyme，ME）是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧为丙酮酸和CO₂，同时伴随着NAD(P)⁺的还原；苹果酸酶普遍存在于生物体内；根据辅酶因子的不同，苹果酸酶可分为两种：NAD-苹果酸酶（NAD-Malic enzyme；NAD-ME；EC 1.1.1.38 和EC 1.1.1.39 ）和NADP-苹果酸酶（ NADP-Malicenzyme；NADP-ME；EC 1.1.1.40 。本发明主要是针对NADP- 苹果酸酶）基因进行研究。

通常认为，NADP-ME为各种细胞组分的合成提供还原力NADPH。例如在产油微生物油脂合成代谢调控中，NADP-ME持续为脂肪酸合成酶进行链延伸提供NADPH（Song Y D, Wynn J P, et al, Microbi, 2001, 147（6）: 1 507-1 515. ）。NADP-苹果酸酶在植物的生长代谢及发育过程中也扮演着重要角色，植物中苹果酸酶的底物和产物参与多种代谢途径，包括光合作用和呼吸作用。如热带C₄植物中的固碳作用，保持植物细胞的渗透势，稳定细胞质的pH 和保持植物根系的离子吸收平衡起重要作用，是生物体生命活动中重要的酶之一(Drincovich M F, Casati P, Andreo C S,FEBS Letters, 2001, 490:1-6.4;Martinoia E, Rentsch D,Annual Review of Plant Physiology and PlantMolecular Biology, 1994, 45: 447- 467.)。此外，植物NADP-ME 被认为参与植物防御反应。另有报道表明，NADP-ME 参与了果实的成熟，通过苹果酸代谢来平衡细胞内的pH，还通过代谢提供碳源和NADPH 调节一些底物及辅助因子来参与脂肪酸的合成。

NADP-ME也是景天酸代谢途径（CAM）植物的一种重要脱羧酶，酶活性昼高夜低；兼性CAM植物随着C₃光合型向CAM型转化，其NADP-ME酶活性涿渐升高，干旱诱导CAM植物其NADP-ME酶活性比C₃增加3倍，由此表明：NADP-ME在CAM植物的活性调节中起重要作用。在CAM运行和调节中，NADP-ME和PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）羧化酶一样，具有重要调节作用(王晨，西北植物学报，1997，17（2）: 200-204.)。

苹果酸酶作为生物体中枢代谢途径的关键酶，也可应用于厌氧混合酸的发酵工程及酿酒工业。因此本发明通过发掘高效、特异性新基因苹果酸酶MI3410ME1，与pET-32a(+)质粒进行重组，并实现在E.coli BL21中表达。为苹果酸酶应用于工业和农业奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中分离的苹果酸酶基因RKME1及该基因编码的氨基酸，或与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1623bp（碱基），其中1-1623为编码苹果酸酶成熟多肽的开放阅读框；该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的另一目的是提供一种含有苹果酸酶基因RKME1的重组表达载体pET32a RKME1，该重组表达载体是将SEQ ID NO:1所示基因直接与载体pET32a（+）所构建的重组表达载体。

本发明另一目的是提供一种含有上述的苹果酸酶基因RKME1或上述的重组表达载体的宿主表达细胞。