[发明专利]一种快速鉴定核酸扩增产物的密闭实验系统装置及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及核酸扩增技术和侧向层析技术等多项技术集成的生物技术领域，尤其涉及一种快速鉴定核酸扩增产物的密闭实验系统装置及应用。

背景技术

近年来，随着社会发展和生物医学技术的进步，每年进行的多种样品核酸检测数量都在大幅增加，对现场快速检测处理速度的各项要求越来越高，现场操作要求灵敏度高。简便快捷的需求也日益迫切。

自1985年美国PE-Cetus公司的K.B Mullis等人首创了PCR技术之后，它以相当惊人的速度被广泛地应用于医学及分子生物学等各个领域。近20年来PCR技术在生物医学等各个研究领域和临床应用中发挥了重大的作用。现今，PCR技术已成为一种对标本中特定的DNA片段进行分析研究和检测鉴定的重要方法。几乎所有涉及到分子生物学核酸的研究都要用到PCR，在病原体鉴定、遗传病诊断、免疫学研究、癌基因探索及治疗等方面都作出了相应的贡献。

PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠非常重要，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。凝胶电泳分析：目前PCR检测主要用琼脂糖、聚丙烯酰胺电泳产品，琼脂糖电泳检测虽然比较简单，但需要EB溴乙锭染色，紫外灯下观察，检测的灵敏度在ng级，需要标准的Marker进一步判断产物的特异性；聚丙烯酰胺电泳胶体制备过程比较复杂，之后的显色过程也比较复杂，整个检测时间耗时长。

LAMP技术最早由日本科学家Notomi等(2000)建立，通过针对靶基因的6个区域而设计4种特异性引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下(60-65℃)高效(0.5-1h)扩增目标DNA。与目前广泛流行的PCR核酸扩增技术相比，该技术具有不依赖温度循环仪(PCR)等昂贵仪器，且灵敏度高，特异性好，反应速度快等优点。因此，已作为一种新兴技术用于临床疾病诊断、流行性细菌或病毒的现场快速检测、动物胚胎性别鉴定及基因芯片开发等领域。在病毒检测领域，目前已依托LAMP技术开发出用于快速诊断检测包括乙肝肝炎病毒、流感病毒、SARS冠状病毒、单纯疱疹病毒在内的多种流行病毒的方法(Hong et al.,2004；Enomoto et al.,2005；Kaneko et al.,2005；)。在细菌检测领域，该技术也广泛应用于结核分支杆菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、痢疾志贺菌的快速检测(Iwamoto et al.,2003)。基于Y染色体上特异序列的差异，Hirayama等(2004)利用LAMP技术开展了对牛早期胚胎性别的快速检测，将LAMP技术应用到了一个全新的领域。

自PCR和LAMP发明以来，实现了核酸的特异性扩增以来，得到了广泛的应用，但是由于高灵敏、高特异性和高效性，导致假阳性结果出现。造成假阳性实验失败的原因很多：1.样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2.试剂的污染：主要是由于在试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。3.扩增产物污染：这是扩增反应中最主要最常见的污染问题。极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。4.气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。5.实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题比较常见。

尤其随着LAMP技术的日益发展，两个阻碍其在基层的应用推广的瓶颈问题也逐渐凸显出来；首先是LAMP的灵敏性带来的气溶胶污染问题，由于LAMP方法对于靶序列的扩展灵敏且扩增量大，为应对这一问题，对于LAMP技术目前在实际应用过程中一般要求“要严格分区，规范操作”，即，根据LAMP操作流程将实验区分为“样品处理区，溶液配制区，模板添加区，检测区”，而且在操作过程中要严格按照模板最后加入，先阴性、后阳性，从低到高的浓度进行操作。对于这样严格苛刻的要求，在实际基层使用过程中很难做到，进而使得该技术在基层现场检测中难于推广。其次是现场检测的结果证据可视化，为了使用结果一目了然，要有更方便的可视化检测系统。