[发明专利]一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测用质控品及其制备方法

说明书

本发明涉及一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测用质控品及其制备方法，质控品由携带HCV保守基因的重组流感病毒经扩大培养灭活纯化而得。制备方法包括：(1)构建用于流感病毒拯救的在PR8病毒NS基因上插入HCV保守基因的质粒；(2)将上述构建好的质粒，与分别转录表达PR8病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M的质粒共转染293T细胞，拯救获得携带HCV 5’UTR的重组流感病毒；(3)将上述重组流感病毒进行扩大培养、灭活、纯化，即得。本发明可真实模拟HCV病原体，实现对HCV检测的全方位监测；易于大规模制备，降低成本，稳定性好，易于保存和运输，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于HCV核酸检测领域，特别涉及一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测用质控品及其制备方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是一种经血液传播的RNA病毒，可以引发各种慢性肝病，其中包括肝硬化和肝细胞癌。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％，估计约1.7亿人患有慢性丙肝，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。我国是HCV慢性感染率高发国家之一，约有3800万HCV感染者。HCV慢性感染导致肝脏发生慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可能发展成肝硬化乃至肝癌，可严重影响生命健康。因此，对其进行快速、准确、有效的检测至关重要。

实时荧光定量RT-PCR因其灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确与高通量等优点，已逐步成为HCV检测的一线方法，广泛用于疾病的早期诊断、病情估计、指导用药和疗效监测中。

实时荧光定量RT-PCR包括样本核酸提取、RNA逆转录为cDNA、cDNA扩增和产物分析四个步骤，检测过程较为复杂，容易受到多种因素的影响。这些因素可能源自于样本自身，如标本中血红素、肝素、尿素等干扰物质会对PCR反应产生抑制作用。也可来源于人为因素，如实验人员操作失误造成样本核酸抽提质量不佳或者核酸丢失，可导致靶值偏低乃至假阴性结果。另外，保存、运输环境中RNA酶和温度等因素引起的病毒核酸降解也不容忽视。因此，核酸扩增实验中必须采用严格的质量控制措施，需要特定的阳性质控品防止假阴性结果，这对于保证核酸检测结果的准确、可靠具有重要的意义。

目前HCV核酸检测用质控品主要有以下几种：裸露的RNA、阳性病人血清或血浆、人工制备的假病毒颗粒。裸露的RNA由cDNA经体外转录得到，极易被环境中的核糖核酸酶(RNase)所降解而难于长期保存，且其不参与核酸抽提过程，因而不能反映病毒的提取效率。阳性病人血清或血浆相对稳定，可对标本核酸提取及反转录过程进行监测，但因其有潜在生物安全性、样本来源有限等问题限制了其在临床检测中的应用。为此，相关政府职能部门鼓励生产厂家研发人工合成质控品以替代上述质控品。

近些年来国内外学者进行了大量探索，当前最具代表性的就是Armored RNA技术制备的假病毒颗粒。它利用MS2噬菌体衣壳蛋白自我组装的特性，采用原核表达技术将特定病毒RNA包装到MS2噬菌体衣壳蛋白内得到带有检测靶标的噬菌体样颗粒。噬菌体颗粒RNA由衣壳蛋白保护，能够抵抗核酸酶及各种理化环境因素，具有稳定性好、无生物传染隐患、可全程监测核酸检测过程等特点，因而解决了传统HCV RNA质控品自身存在的一些问题。目前已有研究机构利用此技术平台人工合成能模拟临床标本的HCV质控品，在HCV临床分子诊断中展示了较好的应用前景。