[发明专利]一种猪胃肠道内容物代谢组学提取方法

说明书

技术领域

本发明属于代谢组学技术领域。具体涉及一种猪胃肠道内容物代谢组学提取方法。

背景技术

应激与断奶综合症等因素引起的仔猪肠道健康问题是导致仔猪死亡和养猪生产效益下降的重要原因。仔猪消化不良会引起腹泻和细菌感染，并引起免疫力下降，发病率增加，甚至死亡。由于饲料到达肠道后首先会经过肠道菌群的作用，所以肠道菌群在饲料消化、吸收和代谢以及菌群代谢物在影响宿主代谢中均扮演着重要角色。肠道菌群作为定植在肠道中的特殊群落和肠黏膜细胞一起参与日粮碳水化合物、氨基酸、脂质等营养物质的代谢，对饲料营养物质的代谢和利用产生深远的影响。比如，肠道微生物对肠腔内尿素的水解和对日粮氨基酸的脱氨基作用会导致用于体蛋白质合成和沉积的日粮氨基酸分解和损失，特别是必需氨基酸。猪肠道微生物与黏膜对氨基酸的竞争利用并共代谢，肠道微生物和肠黏膜的蛋白质周转迅速且量大。受日粮因素和肠黏膜分泌物的刺激，肠道微生物可通过调节自身的基因表达和蛋白分泌，以适应肠道内环境²。肠道微生物可以代谢氨基酸产生氨和其他氨基酸等代谢物，也能利用氨态氮合成氨基酸。因此，肠道微生物不仅对碳水化合物代谢具有影响，而且可以调节宿主的氨基酸池和氮周转。

随着代谢组学研究的不断深入和研究领域的不断拓展，肠道内容物代谢组学研究也成为了目前代谢组学的热点应用领域之一。肠道内容物代谢组的研究方法，主要可以分为菌群代谢足迹和代谢指纹的研究方法，菌群代谢足迹是对其微生物体外代谢产物的表征和变化规律的研究，而代谢指纹是对其微生物体内所有代谢物的定性和定量研究，其关系见图1所示。通过代谢指纹的表征可以得到微生物代谢的最直接证据，实时的反映其代谢的过程和行为，而通过代谢足迹则可以得知其代谢的结果，而且往往代谢足迹有蓄积的作用，这样就可以放大代谢指纹的结果，更加利于检测和表征。

目前关于肠道内容物代谢组的研究刚刚起步，尚有许多方法学的问题有待解决。一方面，不同肠段的pH值变化非常大，成年猪胃内容物的pH值在2.0-3.5之间、空肠和回肠pH值在6.0-7.5、盲肠pH值在4.5-6.0之间、结肠和直肠pH值在5.0-8.0之间。内容物从胃到直肠被排出体外，pH值也从2变化到8左右。这主要与内容物中酸性和碱性物质组成和比例相关。此外，pH值还会随着摄入食物的组成和胃肠道状态而出现变化。所以，胃肠道内容物的pH值可能存在从2到8的一段较大的动态范围。而内容物中的不同成分，对pH值的反应也会不同，这对内容物中化合物的提取造成了较大影响。并且基于NMR的代谢组学分析方法中，NMR检测对pH值有着严格要求，因为pH值对化学物质的化学位移有着大的影响。所以，对于基于NMR的代谢组学研究中，找到针对于胃肠道内容物合适的pH值是十分必要的。其次，胃肠道内容物组成研究中，最为普遍的方法是氨基酸和短链脂肪酸的检测方法。由于进行氨基酸检测时，需要高温(110℃)和强酸条件下消解⁶，无法保留肠道内容物的原貌，特别是短链脂肪酸。而短链脂肪酸的检测方法也不能检测氨基酸等其他的化合物。肠道菌群除了产生甲酸、乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸外，还会产生其他重要的代谢物。比如，采用氯仿、甲醇和水提取法提取到枯草杆菌包括糖酵解和三羧酸循环代谢物的上百种物质。

因此，由于代谢组学分析需要保持代谢物的原貌而且力图检测到尽量多的代谢物，这就需要对目前存在的提取方法进行筛选和优化，避免温度过高、操作过于繁琐和提取效率较低的提取方法，进而找到适合于胃肠道内容物代谢组学分析的提取方法。

现有尹富贵等采用的肠道内容物氨基酸提取方法：称取冻干回肠末端内容物0.5g置于安培瓶中，加入6mol/L盐酸10ml后混匀，密封。110℃消化24h，定容至100ml，吸取2ml经0.25m微孔滤膜过滤，用L-8800型全自动氨基酸分析仪测定15种氨基酸(Phe、Tyr、Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Asp、Glu、Cys、His、Lys、Arg、Thr和Ser)的含量，然后乘以稀释倍数换算成内容物中氨基酸的含量。其缺点是采用浓硫酸和硝酸高温消解肠道内容物蛋白质和氨基酸，具有耗时，环境污染大等缺点。