[发明专利]一种金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄免疫球蛋白可变区单链抗体及用途

说明书

技术领域

本发明涉及鸡卵黄免疫球蛋白可变区单链抗体，特别涉及新的金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄免疫球蛋白可变区单链抗体，及其可变区的氨基酸序列和DNA编码序列，还涉及所述抗体的制备方法和用途。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是人和动物的重要病原菌，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，是革兰氏阳性菌的代表，可引起心内膜炎、肺炎、败血症等许多严重感染。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。目前，对金黄色葡萄球菌感染的治疗，主要以抗生素为主，但其滥用导致耐药细菌频现，并且禽畜产品中抗生素残留问题也对食品安全和人体健康造成严重威胁。因此，利用特异性抗体代替抗生素将是解决细菌耐药性的新型绿色安全途径之一。

卵黄抗体(IgY)，是在特异性抗原刺激下由禽类B淋巴细胞产生并转移到卵黄中的多克隆抗体。IgY以其性质稳定、特异性强、制备简单、成本低等优势而成为最具有应用前景的抗生素替代品。已有报道证明，IgY可替代抗生素治疗沙门氏菌、幽门螺杆菌等细菌引起的胃肠道疾病。虽然IgY有诸多优点,但是蛋鸡免疫所获得的特异性IgY仅占IgY总含量的2-10％，且分离纯化过程繁琐，即使纯化后获得了高纯度特异性IgY，也难以通过体外酶解等手段获得特异性IgY活性肽。因此，如何获得高活性、性能稳定，甚至能通过基因工程菌大量表达的IgY活性肽，是突破IgY难以大量提纯瓶颈的关键，也是研究IgY抗菌机理必须解决的问题。

噬菌体抗体库技术(Phage Antibody Library Technology)是噬菌体展示技术和多克隆抗体构建技术相结合的产物。通过噬菌体展示技术将多克隆抗体展示于噬菌体的表面，构建成噬菌体抗体库，之后通过生物淘选、抗体活性检测等手段获得特异性的抗体。相对于传统的单克隆多克隆抗体，噬菌体抗体库所包含的抗体具有很多优点：1.含有完整的抗原结合位点，并且大小为完整抗体的1/6，更易于基因操作；2.只有抗体的V区，所以免疫原性小；3.噬菌体展示抗体库中的抗体都表达在噬菌体的表面，方便生物淘选；4.获得的抗体，后期大量制备周期短，纯化过程简单、特异性的目的抗体收率高。5.可以获得抗体的核酸序列，便于药物作用机理的研究。

综上所述，利用基因工程技术和噬菌体抗体库技术制备特异性IgY可变区单链抗体(ScFv)，对于克服特异性IgY难以大量提纯，影响其产业化应用问题有极其重要的意义。同时也为特异性IgY基因工程菌表达和其抑菌机理研究奠定了关键基础。

发明内容

本发明的第一方面提供一种新的金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)可变区单链抗体(ScFv)，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，及SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明采用如下方法得到一种金黄色葡萄球菌特异性鸡卵黄免疫球蛋白可变区单链抗体，命名为SF_V6。通过鸡IgY重链和轻链可变区基因框架区1(FR1)和框架区4(FR4)保守序列设计引物，扩增抗体V_H和V_L基因，利用Linker序列将两者连接成S_CF_V基因，保证了抗体的多样性。所获S_CF_V基因与T7select10-3b载体相连接，之后用包装蛋白包装构建成噬菌体抗体库，通过生物淘选、测序等方法，从血液噬菌体文库获取了1个即含V_H又含V_L的S_CF_V全长抗体，从脾脏噬菌体文库获取了2个S_CF_V全长抗体。三个全长S_CF_V连接到原核表达载体，诱导表达后的可溶性蛋白经间接ELISA鉴定具有抗体活性。其中，脾脏来源的噬菌体S14在阻断ELISA中表现出对阳性一抗的阻断率达50％以上；其对应的可溶性蛋白SF_V6不仅在间接ELISA中表现出特别强的抗原亲和性，而且在体外抑菌实验中表现出良好的抑菌效果。目前，尚未发现具有本发明序列的噬菌体抗体。

本发明的第二方面提供含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的重组表达载体，所述载体选自原核或真核表达载体，优选为pCold I。