[发明专利]基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及microRNA的检测领域，特别涉及一种基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法。

背景技术

microRNA是一类内源性的具有基因调控功能的非编码RNA，其大小约为18～25个核苷酸。microRNA能够参与细胞内多种调控通路，包括发育、细胞增殖和凋亡、器官形成、造血过程、病毒防御、代谢等。越来越多的研究发现，microRNA在肿瘤发生发展过程中起至关重要的作用，已成为一类理想的肿瘤标记物。所以定量检测microRNA对了解其生物功能，癌症的早期诊断、新药的开发及其他涉及生物的科研项目，都具有十分重要的意义。与传统的核酸检测相比，microRNA具有的一些独有的特点，如序列短，家族序列同源性高及低丰度表达，这些特点增加了其检测的难度。目前检测microRNA的方法主要有Northern印迹分析，微阵列芯片技术，聚合酶链式反应(PCR)等。虽然Northern印迹是当前microRNA分析的标准方法，但操作繁琐，耗时长，灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，而且对污染非常敏感，实验中每一步操作不当都会影响分析结果。微阵列芯片技术虽然可实现高通量，多组分同时检测，但是其制作和检测费用高；芯片上可利用的样品体积很小，导致灵敏度不高；此外，microRNA序列短，序列相似性高，不能同时优化所有待测的microRNA杂交环境，所以选择性不高。聚合酶链式反应(PCR)是现在定量检测microRNA的主要方法，包括引物延伸RT-PCR，茎环引物RT-PCR和microRNA加尾RT-PCR等方法。虽然基于聚合酶链式反应的microRNA检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高等特点，但是需要逆转录操作，增加了实验的成本和设计的复杂性。随着新的microRNA序列不断发现和对microRNA功能研究的逐步深入，对microRNA的分析检测提出了新要求。因此，开发简单直接，灵敏度高，特异性强，准确检测microRNA的分析技术仍然是一个挑战。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，此法具有操作简单，灵敏度高，特异性强，背景信号低，适用范围广等优点。

本发明采用的技术方案如下：

一种用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，包括以下步骤：

步骤1)将电极浸入含0.1μM的第一DNA片段分子的溶液中，在37℃下反应6小时，随后将电极浸入含0.1M的巯基己醇的溶液中，在37℃下反应1小时；其中，所述第一DNA片段分子含有至少一个巯基和一个氨基；

步骤2)将电极浸入含饱和银纳米颗粒的溶液中，在37℃下反应1小时，随后将电极浸入含1μM的第二DNA片段分子的溶液中，在37℃下反应0.5小时；其中，所述第二DNA片段分子能够与所述第一DNA片段分子进行碱基互补配对；

步骤3)分别配制至少四种不同浓度的microRNA标准液；

步骤4)将电极浸入microRNA标准液中，加入1μM的第三DNA片段分子、5单位的Klenow片段和5nmol的dNTPs，在37℃下反应1小时；所述第二DNA片段分子能够与游离态的microRNA发生反应形成杂交体，所述第三DNA片段分子能够通过链置换反应将microRNA从该杂交体中再次解离出来，使microRNA回到游离态，起始新一轮的杂交与链置换反应；

步骤5)将电极浸入100μL浓度为0.5unit/μL的Nt.BbvCI溶液中，在37℃下反应1小时；

步骤6)取出电极，将其作为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极、铂丝电极为对电极、0.1M的氯化钾溶液为电解液，采用线性扫描伏安法进行检测，将得到的电信号与microRNA标准液的浓度关系绘制成标准曲线图；

步骤7)将经步骤1)和2)修饰后的电极浸入待测液中，按步骤4)～6)的方法得到待测液的电信号，通过与标准曲线图进行比对，得到待测液中microRNA的浓度。

优选的是，所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其中，所述线性扫描伏安法的扫速为100mV/s。

优选的是，所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其中，所述microRNA标准液的浓度不超过10nM。