[发明专利]用于河流弧菌LAMP-LFD检测的引物和探针序列及引物和探针的应用

说明书

技术领域

本发明涉及检测河流弧菌的引物和探针序列，尤其是涉及一种用于河流弧菌LAMP-LFD检测的引物和探针序列及引物和探针的应用。

背景技术

河流弧菌为嗜盐性革兰性阴性菌，广泛分布于河流和近海口水域，可导致鱼虾贝等多种水生动物患病，是海水养殖的主要病原菌之一。同时，河流弧菌可从不同水体、城市污水、动物和人类粪便，以及水产品中分离得到，感染后导致人出现严重的水样腹泻，伴随呕吐、腹痛、发烧，以及不同程度的脱水等症状。在美国，该细菌还被认为是引起婴儿小肠结肠炎的重要病原之一。因此，河流弧菌已成为一种重要的全球性人兽共患病病原菌，不仅危害水产养殖业的发展，而且对食品安全和人类健康也构成了严重威胁，迫切需要建立快捷、灵敏，特异的检测技术用于基层检测。

目前，河流弧菌的检测以传统的细菌分离培养、生化鉴定为主，但是该方法存在检测周期长、费时费力等缺点，而且检测人员需要专业的知识背景，远不能满足疾病的快速诊断和及时治疗。尤其，该病原菌被认定为人兽共患病病原菌使得对于该病原的快速准确鉴定变得更加重要。以蛋白或核酸为检测靶标的分子检测技术，因其检测快速、灵敏度和特异性高等优点，在病原微生物的诊断与鉴定等领域获得了广泛使用。但针对河流弧菌分子检测技术的相关报道还很少，国内的相关专家对河流弧菌的检测研究进行了一定的探索。也取得了一些有效的成果。鄢庆枇等通过利用灭火的河流弧菌抗原制备了效价较高的特异性抗血清，利用该血清建立了河流弧菌的荧光抗体检测技术应用于牙鲆(Paralichthysolivaceus)体内该病原的检测；文万侥等基于toxR基因建立了河流弧菌的PCR检测技术，针对细菌纯培养物的检测灵敏度可达10³cfu·mL^-1数量级；曹际娟等将PCR技术与高效液相色谱联合应用于河流弧菌的检测，也取得了较好的效果。但是，这些方法存在着实验设备要求高，工作环境严格，仅限于实验室诊断，不能很好的在基层检测中普及推广。

环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）自被报道以来，凭借其低设备依赖性、高灵敏度和特异性等优势，在基于核酸扩增的检测领域取得了巨大成功。但该方法在检测过程的某些阶段也存在很大的改善空间，其中一个重要的亟待解决的问题就是针对扩增产物做到如何有效、准确判读。常用的方法是使用琼脂糖凝胶电泳，该方法成本较低，但需接触EB等有毒试剂，而且很难避免环境中气溶胶污染；利用浊度或荧光检测不仅增加了检测成本，而且易产生假阳性；这在一定程度上限制了该技术的推广。LAMP-LFD技术是将LAMP的反应产物与特异性的探针杂交，通过荧光素标记在横向流动试纸条（lateralflowdipstick，LFD）上完成显色和结果判读。该方法不需要EB等有毒试剂，也摆脱了对电泳装置和凝胶成像系统等的依赖，肉眼即可观察到反应结果，在微生物的基层检测和现场快速检测中展现了重大潜力。目前，该技术已成功运用于传染性脾肾坏死病毒（Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus，ISKNV）、传染性肌肉坏死病毒（Infectiousmyonecrosisvirus，IMNV）、创伤弧菌（Vibriovulnificus），以及海豚链球菌（Strepstococcusiniae）等水产病原微生物的检测，国内外还未见报道将该技术应用于河流弧菌的诊断和检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快，检测成本低，检测灵敏度和准确性高的用于河流弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列及引物和探针的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种用于河流弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列，根据河流弧菌的外膜蛋白ompU（GenBank登录号：KC182592）的编码序列设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，引物序列具体如下：

VflompU-F3：5’-TCATGGCTTACCACGGTA-3’

VflompU-B3：5’-GGTGTAAGACGCTGCTAG-3’，

VflompU-FIP：5’-AGTTGAACCGTCATCGCTACGttttGGCCAGTTCTCTGACCTA-3’，

VflompU-BIP：5’-TCTACGCAATCGGCGACACttttCTTTGTCTTGGTCAGCGT-3’，