[发明专利]XRCC2启动子、含有XRCC2启动子的载体、载体的构建及应用

权利要求书

1.一种XRCC2启动子，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种含有XRCC2启动子的载体，其特征在于，包括pXRCC2-GFP、pXRCC2-Luciferase、pXRCC2-DTA、pXRCC2-其他毒蛋白、AAV-pXRCC2-Luciferase及Fugw-pXRCC2-Luciferase，其中pXRCC2指代XRCC2启动子。

3.根据权利要求2所述的一种含有XRCC2启动子的载体，其特征在于，所述的DTA为白喉毒素的A亚基，其序列如SEQ ID NO.2所示；所述的其他毒蛋白包括凋亡家族蛋白caspase3、caspase6、caspase7、caspase8。

4.一种如权利要求2所述的含有XRCC2启动子的载体的构建方法，其特征在于，

(1)pXRCC2-GFP质粒的构建：

以人皮肤成纤维细胞系细胞的基因组DNA为模板，XRCC25’及XRCC23’分别为上下游引物，PCR扩增5’端含有EcoRI、3’端含有AgeI酶切位点的pXRCC2序列，将pRad51C-GFP质粒及扩增完成的pXRCC2片段用限制性内切酶EcoRI及AgeI进行酶切，跑胶鉴定并回收相应片段后进行连接反应，构建完成pXRCC2-GFP质粒；

(2)pXRCC2-Luciferase质粒的构建：

以pXRCC2-GFP质粒为模板，采用上下游引物XRCC2-Luciferase 5’及XRCC2-Luciferase 3’PCR扩增两端分别含有NheI及HindIII酶切位点的pXRCC2，将pXRCC2片段与pGL3-basic质粒采用NheI及HindIII进行酶切，跑胶鉴定后，分别回收pXRCC2片段及pGL3-basic质粒的线性化片段并进行连接反应，构建完成pXRCC2-Luciferase质粒；

(3)pXRCC2-DTA质粒的构建：

采用上下游引物XRCC2-DTA 5’及XRCC2-DTA 3’，以Ad2-DTA-NHEJ质粒为模板PCR扩增两端分别含有AgeI与NotI酶切位点的DTA片段，将该DTA片段及pXRCC2-GFP质粒分别采用AgeI及NotI进行酶切，回收相应片段并进行连接反应，构建完成pXRCC2-DTA质粒；

(4)AAV-pXRCC2-Luciferase质粒的构建：

将正义链序列为CGCGTGCTAGCGAATTCGGTACCT，反义链序列为CTAGAGGTACCGAATTCGCTAGCA的oligo进行褪火反应，并分别采用限制性内切酶MluI及XbaI酶切经褪火完成的片段，同时将AAV-MCS质粒采用限制性内切酶MluI及XbaI酶进行酶切，连接酶切完成后的相应片段，构建完成的质粒命名为质粒1，将质粒1及pXRCC2-Luciferase质粒采用NheI及XbaI酶切后的相应产物进行连接反应，构建完成AAV-pXRCC2-Luciferase质粒；

(5)Fugw-pXRCC2-Luciferase质粒的构建：

设计并合成正义链序列为TAAGCTAGCTCTAGAG，反义链序列为TAATTCGATCGAGATCTCTTAA的oligo片段，进行褪火反应，分别采用限制性内切酶PacI及EcoRI酶切Fugw慢病毒载体，胶回收后得到线性化片段，连接该线性化片段和已褪火的oligo片段，得到Fugw-oligo载体，采用限制性内切酶NheI、XbaI及SalI酶切pXRCC2-Luciferase质粒，并同时采用NheI及XbaI酶切Fugw-oligo载体，跑胶鉴定后胶回收pXRCC2-Luciferase和Fugw-oligo线性化片段并进行连接反应，构建完成Fugw-pXRCC2-Luciferase质粒。

5.根据权利要求4所述的一种含有XRCC2启动子的载体的构建方法，其特征在于，引物XRCC25’序列如SEQ ID NO.7所示，

引物XRCC23’序列如SEQ ID NO.8所示，

引物XRCC2-Luciferase 5’序列如SEQ ID NO.9所示，

引物XRCC2-Luciferase 3’序列如SEQ ID NO.10所示，

引物XRCC2-DTA 5’序列如SEQ ID NO.11所示，

引物XRCC2-DTA 3’序列如SEQ ID NO.12所示。