[发明专利]一种组织工程皮肤的制备方法

权利要求书

1.一种组织工程皮肤的制备方法，其特征在于：是由脱细胞猪胸主动脉血管内膜、皮肤成纤维细胞和表皮细胞制成，是在脱细胞猪胸主动脉血管内膜两侧分别种植成纤维细胞和表皮细胞构建而成；

所述的脱细胞猪胸主动脉血管内膜按以下方法制备：

(1)取检疫合格月龄大于5个月的猪，无菌开腔，取胸主动脉，用医用生理盐水漂洗干净后，钝性分离制得厚度为0.3～0.5mm的血管内膜，再用医用生理盐水清洗，制得猪胸主动脉血管内膜；

(2)将步骤(1)所得的猪胸主动脉血管内膜置于1M的氯化钠溶液中，并在37℃恒温摇床中以100～150r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；

(3)将步骤(2)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为10mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液中，并在37℃恒温摇床中以100～150r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，12～24h后用医用生理盐水漂洗干净；

(4)将步骤(3)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为2.5mg/mL的胰酶溶液中，并在37℃恒温摇床中以100～150r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，24～36h后用医用生理盐水漂洗干净，即得脱细胞猪胸主动脉血管内膜，贮存于75％乙醇中备用。

2.根据权利要求1所述的组织工程皮肤的制备方法，包括培养基配制以及组织工程皮肤的构建，其特征在于包括以下步骤：

a.按1：9的体积比将DMEM培养基与进口胎牛血清混合后，此基础上每500mL再添加氢化可的松100～500μg，胆固醇5～8mg，转铁蛋白1～5mg，维生素C10～20mg，胰岛素2～5mg配制成基础培养基；再以基础培养基配制以下培养基，其中添加物浓度为终浓度：

成纤维细胞培养基：基础培养基+碱性成纤维细胞生长因子0.05～0.1ng/mL；

表皮细胞培养基：基础培养基+牛垂体提取液50～100μg/mL+表皮细胞生长因子5～25ng/mL+乙醇胺0.1mM+碱性成纤维细胞生长因子0.01～0.05ng/mL+氯化钙0.05mmol/L；

b.将所述步骤(4)得到的脱细胞猪胸主动脉血管内膜用医用生理盐水漂洗去除酒精后，在其一侧按2×105～5×105个/cm2接种成纤维细胞，加入成纤维细胞培养基淹没皮肤表面，每天换液，培养7～10天；

c.将步骤b中得到的已接种成纤维细胞的脱细胞猪胸主动脉血管内膜置于培养支架上，在未接种细胞的一侧，按2×105～5×105个/cm2接种表皮细胞，加入表皮细胞培养基淹没材料表面，每天换液，培养12～18天后，扫描电镜观察形成表皮层和真皮层后，即得组织工程皮肤。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述溶液中的溶剂均为超纯水。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述溶液中均含有青霉素和链霉素，所述溶液中青霉素与链霉素的浓度分别为100U/mL、100μg/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述医用生理盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠溶液。