[发明专利]一种可用于减缓单分子荧光漂白现象的除氧试剂及其应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及单分子荧光检测技术领域，尤其涉及一种可用于减缓单分子荧光漂白现象的除氧试剂及其应用方法。

背景技术

单分子荧光检测是近年来迅速发展起来的一种超灵敏的检测技术，自从1976年Hirschfeld第一次尝试用全内反射荧光法实现以来，单分子荧光检测技术逐渐在化学分析、DNA测序、医学诊断、分子动力学等领域发挥着重要作用。

然而单分子荧光在检测过程中由于受激发光的照射，存在光漂白淬灭效应。光漂白会导致检测时长和检测到的总光子数减少。对单个单分子而言，发射出的总光子数决定了单分子荧光的信噪比，发光的时长决定了样品可检测时长。以基因测序为例，单分子荧光可检测时长决定了DNA测序的读度，因此减缓单分子荧光漂白，增加样品的可检测时长有重要意义。

研究表明，氧分子是单分子荧光发生漂白的主要原因，它导致单分子荧光漂白的方式有两种：一是直接与激活状态的荧光分子发生化学反应，二是通过产生自由基间接地反应。为减缓单分子荧光漂白，必须尽可能地降低溶液中氧分子和氧自由基浓度。常用的除去溶液中氧分子和氧自由基的方法有以下两种：一种是在溶液中加入适当浓度的还原剂去除氧分子的化学方法，但还原剂与氧分子的反应容易引起溶液中pH值的改变；另一种通过加入去氧酶试剂的生物方法，但是体系中温度、pH值、离子浓度均对酶活性都影响较大，使用有较大的局限性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种操作简单、效果显著的减缓单分子荧光漂白现象的除氧试剂及其应用方法，可以有效增加单分子检测时长。

第一方面，本发明提供了一种可用于减缓单分子荧光漂白现象的除氧试剂，所述除氧试剂包括的各组分及其体积份数为：pH＝7.1-9.0、浓度为20-400mM的Tris-HCl缓冲液74-86份，浓度为50-300mM的抗坏血酸钠溶液8-12份，浓度为20-200mM的酪氨酸溶液2-6份，浓度为5-50mM的还原谷胱甘肽溶液4-8份。

优选地，所述除氧试剂包括的各组分及其体积份数为：pH＝7.1-9.0、浓度为20-400mM的Tris-HCl缓冲液81份，浓度为50-300mM的抗坏血酸钠溶液10份，浓度为20-200mM的酪氨酸溶液4份，浓度为5-50mM的还原谷胱甘肽溶液5份。

更优选地，所述除氧试剂包括的各组分及其体积份数为：pH＝8、浓度为100mM的Tris-HCl缓冲液81份，浓度为200mM的抗坏血酸钠溶液10份，浓度为50mM的酪氨酸溶液4份，浓度为50mM的还原谷胱甘肽溶液5份。

优选地，所述抗坏血酸钠溶液是pH＝7.1-9.0、浓度为20-400mM的Tris-HCl缓冲液作为溶剂配制而成。

进一步优选地，所述抗坏血酸钠溶液是pH＝8、浓度为20-400mM的Tris-HCl缓冲液作为溶剂配制而成。

更优选地，所述抗坏血酸钠溶液是pH＝8、浓度为100mM的Tris-HCl缓冲液作为溶剂配制而成。

优选地，所述酪氨酸溶液、所述还原谷胱甘肽溶液是采用双蒸水作为溶剂配制而成。

如本发明所述，如无特殊说明，上述化学品均指市售药品。

如本发明所述的，所述各溶液的浓度均是指在混合前，各溶液自身的物质的量浓度。

本发明中，所述pH＝8、浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液是采用如下方法配制：将50mL、0.1M的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与29.2mL的0.1M的盐酸混匀后，加水稀释至100mL。

1L、pH＝8、浓度为0.1M的Tris-HCl缓冲液：称量12.11g的三羟甲基氨基甲烷,加入700mL双蒸水，搅拌溶解。并加入1M的浓盐酸调节pH，并实时观察温度稳定在25℃，调节pH值至8.0,转入1L容量瓶，定容至1L。

本方法中提供的可用于减缓单分子荧光漂白的除氧试剂中，Tris-HCl缓冲液可以有效地稳定了溶液环境中的pH值；抗坏血酸钠、酪氨酸都是比较温和的还原剂，还原谷胱甘肽能很好的除去溶液中的氧分子和氧自由基，所述除氧试剂的各组分之间是协同的统一整体，各个组分缺一不可，且各个组分的含量既不是越多越好，也不是越少也好，本申请通过调整除氧试剂中各组分的浓度及其比例，既可以有效除去溶液中氧分子和氧自由基，又不会引起体系pH值的变化。可以将所述除氧试剂用于单分子荧光检测领域，减缓单分子荧光漂白现象，有效增加单分子检测时长，提高检测准确度和灵敏度。

第二方面，本发明还提供了一种可用于减缓单分子荧光漂白现象的除氧试剂的应用方法，包括如下步骤：