[发明专利]牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法、培养基及其制备方法

说明书

本发明公开了一种牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法、培养基及其制备方法，属于植物内生菌分离培养技术领域。牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，每1000mL培养基的组成为：金蝉干粉1.5～2.5g，酵母粉4～6g，吉兰糖胶1.5～2.5g，海藻糖0.2～1g，菊糖0.1～1g，NaCl 8～10g，牡丹根际土壤浸提液150～250mL，琼脂粉14～18g，余量为蒸馏水。该培养基整体上用料搭配精当，既适合牡丹根、茎、叶营养器官内生细菌的分离培养，也可用于划线纯化，与传统培养基相比，可分离培养出的菌株种类更加丰富，多样性优势明显，且制备方法简单，便于操作，具有良好的推广应用价值。

技术领域

本发明涉及植物内生菌分离培养技术，具体涉及牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法，以及分离纯化操作中使用的培养基及其制备方法。

背景技术

植物内生菌一般是指生活史的某一阶段生活在植物组织内，对植物生长发育没有引起明显病害症状的一类微生物，如真菌、细菌、放线菌等。植物内生菌往往是植物在特定生境中不同类型微生物经过长期的协同进化形成的一种稳定的共生或寄生关系，内生菌一些生理活性特征与土著微生物类群往往存在差异，是筛选特定菌株、产功能酶菌株或农业生防菌株的良好材料来源。近年来，关于植物内生菌的文献报道逐渐增多。

目前，细菌分离培养基最为经典和通用的是牛肉膏蛋白胨培养基，其配方如下：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉15～20g/L，蒸馏水定容至1000mL，自然pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。该培养基应用极为广泛，为各种材料细菌的分离培养做出了重要贡献。但随着微生物科学研究领域的不断拓展和深入，传统的细菌培养基配方及其制备方法也面临一些窘境，突出的问题主要表现在以下几个方面：(1)培养基配方缺乏持续创新，单一配方经过长期反复使用，使得细菌筛选时菌株的多样性受到严重制约；(2)在使用特殊材料筛选细菌时，传统的细菌培养基配方并没有很好的针对性，往往达不到理想的试验效果，如昆虫内生细菌、植物内生细菌等；因为缺乏培养基创新，因重复筛选造成的试验耗材及试验时间的浪费也成为一个不可小觑的问题。

在一些文献报道中，细菌培养基配方有时也会做一些调整，但根本性的调整并不多，所以，微生物研究中常见菌的重复筛选已经成为制约相关试验研究的瓶颈问题。资料显示，微生物资源的多样性，远没有得到充分的开发和利用，人们所能分离培养的微生物种类仅占总量的1～2％，足见不断创新和改良培养基的必要性和重要的现实意义。

牡丹Paeonia suffruticosa隶属于毛茛科Ranunculaceae芍药属，牡丹花雍容华贵，气势奔放，被誉为“花中之王”。牡丹产业发展迅速，在栽培、观赏、药用、瓷艺、精油、化妆品、膳食等方面均已得到长足发展，形势喜人。但关于牡丹内生菌方面的研究鲜见报道，营养器官内生细菌方面的研究更是空白，因此创新牡丹内生细菌分离的培养基配方，明确牡丹内生细菌分离培养基配方及其制备技术，不仅能拓展微生物资源筛选途径，为下游研究提供技术支撑，还能提高牡丹内生细菌筛出菌株的多样性，丰富牡丹内生菌开发利用理论，尽量减少不必要的重复筛选，为稀有种类的筛出提供更多可能，意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种专门针对牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基。

同时，本发明还提供一种上述分离纯化培养基的制备方法。

最后，本发明还提供一种牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，每1000mL培养基的组成为：金蝉干粉1.5～2.5g，酵母粉4～6g，吉兰糖胶1.5～2.5g，海藻糖0.2～1g，菊糖0.1～1g，NaCl 8～10g，牡丹根际土壤浸提液150～250mL，琼脂粉14～18g，余量为蒸馏水。