[发明专利]高通量转录组文库构建方法在审
申请号: | 201510408114.4 | 申请日: | 2015-07-11 |
公开(公告)号: | CN105019034A | 公开(公告)日: | 2015-11-04 |
发明(设计)人: | 洪旭涛;余文菁;谭海芹;宓娅娜 | 申请(专利权)人: | 浙江大学 |
主分类号: | C40B50/06 | 分类号: | C40B50/06;C12N15/10 |
代理公司: | 杭州中成专利事务所有限公司 33212 | 代理人: | 金祺 |
地址: | 310058 浙江*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 通量 转录 文库 构建 方法 | ||
1.高通量转录组文库构建方法,其特征是:
逆转录生成单链cDNA时所用的特异性引物为带有polyT以及两段特异性序列的引物,
所述特异性引物为:3'-(T)16-TCTAGCCTTC TCGTGTGCAG-GTGCTGCGAG AAGGCTAGA--5'。
2.根据权利要求1所述的高通量转录组文库构建方法,其特征是:
PCR富集时所用的两段特异性引物为:
引物F:
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT3’;
引物R:
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATcgtgatGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT3’。
3.根据权利要求2所述的高通量转录组文库构建方法,其特征是:
滚环扩增中所用的引物为:
RCA-F引物agatcggaagagcacacgtc
RCA-R引物agatcggaagagcgtcgtgt。
4.根据权利要求2或3所述的高通量转录组文库构建方法,其特征是该方法包括以下步骤:
1)、mRNA的分离:
从总RNA中分离mRNA;
2)、mRNA的片段化:
将mRNA打碎成片段;
3)、对片段化后的mRNA加poly A尾:
利用polyA聚合酶以及ATP,在片段化的mRNA的3’端加上碱基A;
4)、逆转录生成单链cDNA:
设计一条带有polyT以及两段特异性序列的引物,与mRNA的polyA结合,并逆转录,加热变性后生成单链cDNA;
5)、单链cDNA的环化:
在单链DNA连接酶的作用下,单链cDNA环化,生成一个环;
6)、PCR富集,文库构建:
利用环上的两段特异性序列,设计两段特异性引物,通过一轮PCR,制备转录组文库。
5.根据权利要求4所述的高通量转录组文库构建方法,其特征是:
在步骤5)和步骤6)之间补充如下的滚环扩增:
通过环上的两段特异性序列,利用Phi29聚合酶,进行滚环扩增,从而生成1千到几万倍的含两段特异性序列的DNA单链。
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