[发明专利]高通量转录组文库构建方法在审

专利信息
申请号: 201510408114.4 申请日: 2015-07-11
公开(公告)号: CN105019034A 公开(公告)日: 2015-11-04
发明(设计)人: 洪旭涛;余文菁;谭海芹;宓娅娜 申请(专利权)人: 浙江大学
主分类号: C40B50/06 分类号: C40B50/06;C12N15/10
代理公司: 杭州中成专利事务所有限公司 33212 代理人: 金祺
地址: 310058 浙江*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 通量 转录 文库 构建 方法
【权利要求书】:

1.高通量转录组文库构建方法,其特征是:

逆转录生成单链cDNA时所用的特异性引物为带有polyT以及两段特异性序列的引物,

所述特异性引物为:3'-(T)16-TCTAGCCTTC TCGTGTGCAG-GTGCTGCGAG AAGGCTAGA--5'。

2.根据权利要求1所述的高通量转录组文库构建方法,其特征是:

PCR富集时所用的两段特异性引物为:

引物F:

5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT3’;

引物R:

5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATcgtgatGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT3’。

3.根据权利要求2所述的高通量转录组文库构建方法,其特征是:

滚环扩增中所用的引物为:

RCA-F引物agatcggaagagcacacgtc

RCA-R引物agatcggaagagcgtcgtgt。

4.根据权利要求2或3所述的高通量转录组文库构建方法,其特征是该方法包括以下步骤:

1)、mRNA的分离:

从总RNA中分离mRNA;

2)、mRNA的片段化:

将mRNA打碎成片段;

3)、对片段化后的mRNA加poly A尾:

利用polyA聚合酶以及ATP,在片段化的mRNA的3’端加上碱基A;

4)、逆转录生成单链cDNA:

设计一条带有polyT以及两段特异性序列的引物,与mRNA的polyA结合,并逆转录,加热变性后生成单链cDNA;

5)、单链cDNA的环化:

在单链DNA连接酶的作用下,单链cDNA环化,生成一个环;

6)、PCR富集,文库构建:

利用环上的两段特异性序列,设计两段特异性引物,通过一轮PCR,制备转录组文库。

5.根据权利要求4所述的高通量转录组文库构建方法,其特征是:

在步骤5)和步骤6)之间补充如下的滚环扩增:

通过环上的两段特异性序列,利用Phi29聚合酶,进行滚环扩增,从而生成1千到几万倍的含两段特异性序列的DNA单链。

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