[发明专利]苯并噁唑酮类化合物水解酶、编码该酶的基因、含有该基因的工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及苯并噁唑酮类化合物水解酶、编码该酶的基因、含有该基因的工程菌及其应用。

背景技术

苯并噁唑酮(BOA)类化合物是存在于禾本科、爵床科、毛莨科、玄参科等植物中特有的化学成分,这类成分对细菌、真菌、昆虫等具有防御作用，同时具有除草、植物生长调节和昆虫拒食等生物活性。BOA类化合物作为一种重要的药物中间体,常被用于抗菌药、解热镇痛药、催眠药等的合成与生产，例如:6-氯-苯并噁唑酮具有抗菌活性,5-氯-苯噁唑酮(氯唑沙宗)具有抗炎活性,临床上用于治疗各种急慢性软组织扭伤、挫伤及慢性筋膜炎等。此外，BOA类化合物作为新农药开发的先导化合物被广泛研究，噁唑禾草灵，噁唑酰草胺，伏杀硫磷等都是已经商品化并广泛使用的农药品种。但是，由于以BOA类化合物作为活性结构的药物和农药的大量使用，将会严重污染生态环境，破坏生态平衡。

环境污染物的降解主要依赖于土壤中微生物的作用，而微生物对物质的降解主要由细胞内的酶来完成。微生物是各种酶的重要来源。通过从环境中分离产酶微生物，利用分子克隆技术从产酶微生物中克隆产酶基因，再将其与合适的载体连接并转入相应宿主细胞，可进行酶的大量表达。通过基因工程技术手段进行生产酶，已经成为工业用酶的主导。因此，筛选能够高效降解BOA类化合物的菌株并研究其代谢机制，对降解基因资源的开发利用和环境污染修复非常具有现实意义。

目前仅有少数致病真菌对BOA类化合物具有抗性，例如，小麦冠腐镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)等，因此，阐述清楚致病真菌对BOA类化合物的脱毒机制尤为重要。研究认为致病真菌对BOA的脱毒过程为：首先BOA在一种β-内酰胺FDB1的作用下转化为邻氨基苯酚，然后再由N-乙酰转移酶FDB2的作用下生成无毒性的N-(2-羟基苯基)丙酰胺酸，邻氨基苯酚也可以被转化为2-乙酰基氨基苯酚。目前对编码FDB2的基因已有明确报道，但是对FDB1对BOA的转化作用仅为一种推测。

发明内容

本发明的目的是针对BOA类化合物严重污染环境的问题，提供一株该类化合物降解菌株。

本发明的另一目的是提供该菌株中克隆得到的降解BOA类化合物的基因、该基因编码的酶、含有该基因的重组表达载体以及含有该基因的工程菌。

本发明的又一目的是提供上述菌株、基因、酶、工程菌的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种苯并噁唑酮类化合物水解酰胺酶基因cbaA，其特征在于，核苷酸序列为：SEQ ID No.1。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1020bp，G+C含量为51.57％，编码339个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQ ID No.2。

所述的苯并噁唑酮类化合物水解酰胺酶酶基因核苷酸序列所编码的BOA类化合物水解酰胺酶蛋白质，其氨基酸序列为：SEQ ID No.2。一种来自于菌株Pigmentiphaga sp.VL-1中的BOA类化合物水解酰胺酶CbaA通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Butyl-650M疏水层析等蛋白质纯化手段，被纯化19倍，回收率达到4％。CbaA纯酶在碱性条件下稳定性较好，温度稳定性强，在pH 7.0-11.0，40℃以下储存24h，酶活力仅损失不到30％；EDTA对酶活无显著影响，表明该酶是不依赖金属离子的非金属酶。CbaA的最适底物为6-氯苯并噁唑酮，比酶活力为5650U·mg protein^-1，Km值为0.36μmol，Vmax为10.94。CbaA同时对苯并噁唑酮、6-氯苯并噁唑酮、5-氯苯并噁唑酮、4-羟基-苯并噁唑酮、6-甲氧基-苯并噁唑酮、6-硝基-苯并噁唑酮、6-氨基-苯并噁唑酮、6-溴-苯并噁唑酮、5-溴-苯并噁唑酮等具有酶活性，表明CbaA可能为一种酰胺酶并且对苯并噁唑类化合物有较好的酶活性。

一种含有本发明所述的苯并噁唑酮类化合物水解酰胺酶基因cbaA的重组表达载体。

所述的重组表达载体，优选出发载体为pET-29a(+)。

含所述的BOA类化合物水解酰胺酶基因的基因工程菌Escherich coli BL21(DE3)。