[发明专利]p38α拮抗肽突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，涉及p38α拮抗肽突变体及其在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。

背景技术

p38是MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase)超家族成员之一，p38家族主要有四个亚型，p38α、p38β、p38γ和p38δ。其中p38α和p38β在组织细胞中遍在表达，而p38γ和p38δ只在特异的组织中表达。p38α和p38β具有较高同源性，在功能上也有一定重叠；但p38α在大多数细胞中处于高表达水平而p38β则处于低表达水平，所以，一般认为p38α是p38家族成员的主要亚型。p38α最初发现是因其是一种能够结合嘧啶咪唑类化合物的酶，能够抑制LPS诱导的炎性因子IL-1和TNF-α在单核细胞内的产生。随后的研究表明，p38α不仅是炎症发展的核心介导因子，在肿瘤生成、细胞存活和氧化应激损伤等方面也发挥重要作用，因此被认为是治疗炎症及的靶点。目前已设计出多种p38α抑制剂，它们作用位点虽然不尽相同，但其本质是相同的，都是与ATP竞争结合p38的催化中心，由于人体内不同的激酶均有高度相似的腺苷结合口袋，致使以竞争结合ATP为作用机制的p38α抑制剂存在不同程度毒副作用。鉴于p38α的ATP竞争性抑制剂临床试验存在安全性问题，所以设计非ATP竞争性p38α抑制剂来替代现有的ATP竞争性抑制剂非常必要。

以p38α与其衔接接头蛋白TAB1[transforming growth factor-β(TGF-β)–activated protein kinase 1(TAK1)-binding protein 1]相互作用为靶点是设计非ATP竞争性p38α抑制剂的策略之一。研究发现，TAB1能够与p38α发生相互作用，促使其第180位的苏氨酸和第182位的酪氨酸发生双位点磷酸化而被激活，而这一过程不需要p38上游MAPK激酶MKK3/MKK6的参与。TAB1与p38α的相互作用具有亚型特异性和结构特异性-即TAB1不与p38的其他三个亚型p38β、p38γ、p38δ发生结合，而且p38α与TAB1相互作用的结构区域不同于它和MKK3/MKK6的相互作用区域。基于此，本课题组之前的工作通过靶向TAB1/p38α设计了一种具有细胞膜渗透性的拮抗肽PT5，并通过体内体外实验证明PT5能够选择性的抑制TAB1/p38α的相互作用，从而在大鼠心肌缺血再灌注损伤模型中减轻心肌的再灌注损伤。急性心肌梗塞是由于冠状动脉血栓形成后导致的组织缺血而引起。冠状动脉的再灌注对于恢复心肌功能非常重要，但刚开始恢复血液再灌注后，不但未减轻反而加重缺血所引起的细胞功能代谢障碍及结构破坏，因而将这种血液再灌注后缺血性损伤加重的现象称为缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤。I/R将会带来一些不良效应，例如氧化应激，细胞内钙超载等，这些不良反应会导致心肌细胞凋亡。研究表明，在缺血再灌注过程中TAB1与p38α相互作用以及TAB1介导的p38α旁路活化在其中起关键作用。

目前，能够有效降低心肌缺血再灌注损伤的干预策略和治疗药物还非常有限。之前工作所设计的PT5拮抗肽有望成为相关药物的先导化合物。然而，PT5中发挥拮抗p38α旁路活化作用的关键氨基酸还是未知的。寻找PT5拮抗肽中相应的关键位点将有助于获得更精确的结构信息并对多肽进行优化，从而为心肌再灌注损伤防治药物提供先导结构。

发明内容

本发明的目的在于提供一种p38α拮抗肽突变体PT5-2。经GST-pull实验和Kinase assay实验证明：PT5突变体PT5-2对于TAB1与p38α相互作用的抑制能力更强。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种p38α拮抗肽突变体，所述突变体命名为PT5-2，所述PT5-2的氨基酸序列为以下组中的任意一个：

(1)如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

(2)在SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。

优选地，所述PT5-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。