[发明专利]脂质体流感病毒抗原疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及流感病毒抗原疫苗领域，特别涉及一种脂质体流感病毒抗原疫苗及其制备方法。

背景技术

现有技术中，用于治疗流行性感冒的表位疫苗主要由化学合成，由于抗原表位仅代表了蛋白抗原的一部分，很难像蛋白抗原疫苗一样诱导出多种免疫反应；且表位疫苗通常是线性的，不具备抗原蛋白上抗原表位所具有的立体构象。因而直接用表位肽免疫很难引起较强的免疫应答。虽然通过表位肽与载体分子连接后可在短期内诱导较好的免疫应答，但是很难保证其免疫应答的特异性，且为达到较好的免疫效果，一方面所需免疫原剂量大，另一方面需要联合使用佐剂，使其进一步临床应用受到很大限制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中表位疫苗难以诱导出多种免疫反应，且难以引起较强的免疫应答，临床应用受到限制等缺陷，提供一种脂质体流感病毒抗原疫苗及其制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明提供了一种脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法，采用反相蒸发法，包括以下步骤：

(1)流感病毒抗原疫苗原液的制备：

取任意一种或多种流感病毒毒株，分别将所述流感病毒毒株接种于病毒培养基上，在33℃～35℃的温度下培养48～72小时后，获得流感病毒体,经甲醛灭活,超滤浓缩、纳米对撞机裂解病毒及柱层析纯化后制成流感病毒抗原疫苗原液；

(2)空脂质体的制备：

将磷脂、胆固醇以及抗氧化剂混合溶于有机溶剂中，减压蒸发有机溶剂后，得到膜状的空脂质体；

(3)单相分散体系的制备：

向步骤(2)中获得的空脂质体中加入乙醚或与乙醚有相似溶解性和极性的有机溶剂溶解膜状空脂质体形成双相分散体系，然后加入碱性缓冲液，在水浴型超声波处理器上超声至混合物形成单相分散体系；

(4)成溶胶体系的制备：

将步骤(3)中获得的混合物通过减压蒸发去除乙醚至凝胶形成，然后继续减压蒸发形成水性悬浊液即脂质体悬液，继续干燥去除乙醚，得到空脂质体，然后加入步骤(1)获得的流感病毒抗原疫苗原液，获得粗制脂质体；

(5)高压匀浆

将步骤(4)获得的粗制脂质体高压匀浆,除菌过滤即可。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述步骤(4)中流感抗原疫苗原液在加入空脂质体之前还包括以下步骤：向流感病毒抗原疫苗原液中加入细胞保护剂。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述细胞保护剂为海藻糖，并使海藻糖在流感病毒抗原疫苗原液中的浓度为1％。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述碱性缓冲液为磷酸盐缓冲液。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述流感病毒毒株包括甲1型、甲3型及乙型流感病毒毒株；所述病毒培养基为5-10日龄健康鸡胚。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述磷脂包括大豆卵磷脂、卵磷脂、豆磷脂、脑磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯中的一种或多种；

所述有机溶剂为三氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮溶液中的一种或多种；

所述抗氧化剂为维生素E、维生素C、维生素A、类胡萝卜素中的一种或多种。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述空脂质体的制备过程为：

将大豆卵磷脂、维生素E、胆固醇分别按摩尔比(4-6)：1：(2-4)混合溶于100ml三氯甲烷中,置于旋转蒸发仪的茄型瓶中,在60℃-100℃条件下水浴,真空旋转蒸发,成膜，获得膜状空脂质体。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，取300mg注射用大豆卵磷脂、150mg胆固醇、50mg维生素E混合溶于100ml三氯甲烷中,将该液体置于旋转蒸发仪的茄型瓶中,60℃水浴作为蒸发温度,真空旋转蒸发,获得膜状空脂质体。

在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述高压匀浆过程为：将粗制脂质体用高压匀浆机在压力为15Kpa-30Kpa压力范围内，匀质5个循环，将脂质体颗粒粒径匀质至200-400nm，除菌过滤。

本发明进一步保护根据上述提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法所获得脂质体疫苗。