[发明专利]具有高β-环化活力的环糊精葡萄糖基转移酶突变体

说明书

本发明公开了具有高β‑环化活力的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明采用定点突变方法将来源于Bacillus circulans STB01的β‑CGT酶第89位的酪氨酸分别突变为甘氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺，双突变体是在将CGT酶第577位天冬氨酸突变为精氨酸的基础上，将第89位的酪氨酸分别突变为甘氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺，所得突变体相比于野生CGT酶，β‑环化活力明显提高，更适合环糊精的工业化生产。

技术领域

本发明涉及具有高β-环化活力的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

环糊精是由D-吡喃葡萄糖通过α-1,4-糖苷键连接而成的环状化合物，其中以6、7和8个葡萄糖单元所构成的α-、β-和γ-环糊精最为常见。由于其呈中空圆筒状结构，具有外部亲水、内部疏水的特性，环糊精能与许多疏水客体分子形成包合物，从而改变客体分子的理化性质，因此，在食品、医药等工业领域中有着广泛的应用。

环糊精的工业化生产均采用酶法工艺，即在环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)催化作用下通过环化反应转化淀粉所合成。由于野生CGT酶作用淀粉生产环糊精的环化活力较低、特异性较差，使得环糊精的工业生产成本较高。

本发明中所使用的来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01的β-CGT酶总的环化活力约为302U/mg，进一步提高该酶的环化活力，将更加有利于环糊精的工业化生产。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种β-环化活力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第89位的酪氨酸分别突变为甘氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺，所得单突变体依次命名为Y89G、Y89D、Y89N。

所述突变体还可以在单突变体的基础上，将第577位天冬氨酸突变为精氨酸，得到双突变体，所得双突变体依次命名为Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R。

编码所述野生CGT酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种获得所述突变体Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R的方法。根据B.circulans STB01CGT酶的基因序列，分别设计并合成引入Gly89、Asp89、Asn89密码子单突变的引物和引入Asp577/Gly89、Asp577/Asp89、Asp577/Asn89密码子双突变的引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出编码Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R突变体的基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB 600中进行表达。

所述方法还进一步包括突变体的表达与纯化：挑取携带编码突变体的质粒的表达宿主B.subtilis WB 600的单克隆于LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以4％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵48h。将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液采用疏水Phenyl HP柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法，分别纯化得到突变体Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R酶制品。

本发明的有益效果：构建了6个有意义的突变体Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R，均实现了重组CGT酶β-环化活力的提高，比野生型CGT酶更适用于环糊精的工业化生产。

附图说明