[发明专利]高接合转移率的希瓦氏菌WP3菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一株高接合转移率希瓦氏菌WP3菌株及其构建方法和应用；所述构建方法包括以下步骤：对深海细菌希瓦氏菌WP3全基因组限制‑修饰系统相关基因进行预测；对预测到的三个限制酶基因分别设计基因敲除引物；以WP3ΔSW1为出发菌株，依次敲除所述的三个限制酶基因，相应获得限制酶基因缺失菌株，所述限制酶基因缺失菌株即为高结合转移率的菌株；相比于基因工程出发菌株WP3ΔSW1，本发明所得菌株结合转移效率明显提高，获得的单交换克隆子阳性率高，筛选单交换克隆子的工作量明显减少；在高结合转移率的菌株的基础上，通过同源重组至少可以一次性删除41kb的基因组DNA片段，有利于进一步的基因组改造。

技术领域

本发明涉及一种高接合转移率希瓦氏菌WP3菌株及其构建方法和应用，具体是提升一株深海来源的希瓦氏菌Shewanella piezotolerans WP3的结合转移效率的方法，最终获得一株高结合转移效率的WP3菌株并在此基础上进行基因组大片段的删除。

背景技术

Shewanella属细菌广泛存在于自然环境，并且是深海中最为丰富的γ-变形菌，其最重要的特征是它们能以利用多种底物作碳源，具有十分出众的厌氧呼吸的能力，同时还具备低温下生长的能力，因此，Shewanella属细菌在生物修复、微生物燃料电池开发等方面具有潜在的应用价值。

目前，Shewanella菌的研究主要集中S.oneidensis MR-1和S.piezotolerans WP3这两株菌上，S.oneidensis MR-1分离自纽约Lake Oneida的沉积物，这株菌在前期已经建立了稳定的遗传操作系统，通过电转化或结合转移均能有效地实现该菌的遗传操作。S.piezotolerans WP3分离自自西太平洋深海沉积物(1914m)，前期尝试电转化对该菌进行遗传操作，但结果并不理想，之后虽然通过结合转移的方法获得了一系列基因敲除突变株，但是由于筛选单交换克隆子这一步骤的效率很低，导致基因敲除的难度较大，从而限制了该菌的遗传学及适应性的研究。因此，对WP3进行基因工程改造，提升其结合转移的效率，具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供一株高接合转移深海细菌希瓦氏菌WP3菌株及其构建方法和应用，目的在于通过基因工程的方法获得一株高结合转移效率的WP3菌株，并在该菌株的基础上尝试基因组大片段的删除。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一株高结合转移效率的希瓦氏菌WP3菌株，所述菌株通过包括如下步骤的方法制得：以WP3ΔSW1为出发菌株，敲除所限制酶基因，相应获得高结合转移率的菌株。

优选地，所述菌株为Δsw1Δswp840、Δsw1Δswp840Δswp2190(WP3-3Δ)或Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9(WP3-4Δ)。

更优选地，所述菌株为Δsw1Δswp840Δswp2190(WP3-3Δ)或Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9(WP3-4Δ)。

特别优选地，所述菌株为Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9(WP3-4Δ)。

第二方面，本发明提供一种所述高结合转移效率的希瓦氏菌WP3菌株的构建方法，所述方法包括以下步骤：

步骤一，对深海细菌希瓦氏菌WP3全基因组限制-修饰系统(R-M system)相关基因进行预测；

步骤二，对预测到的三个限制酶基因分别设计基因敲除引物；