[发明专利]一种用于检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因B1型突变的引物组及应用

权利要求书

1.一种用于检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因B1型突变的引物组，其特征在于，核苷酸如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所示。

2.一种利用权利要求1所述引物组检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因B1型突变的方法，其特征在于，是以待测样品的DNA为模板，以如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所述序列为引物进行第一轮PCR扩增，稀释扩增产物后，再以稀释后的扩增产物为模板，以如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.5所述序列为引物进行第二轮PCR扩增，最后利用高分辨率熔解曲线分析仪器对第二轮扩增产物进行基因型突变检测。

3.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)提取待鉴定材料的DNA；

2)以步骤1)所得的DNA为模板，以如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所述序列为引物进行第一轮PCR巢式扩增，获得扩增产物后，进行稀释处理；

3)以步骤2)中稀释后的扩增产物为模板，以如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.5所述序列为引物进行第二轮巢式PCR扩增，扩增结束后获得第二轮扩增产物；

4)利用20矿物油将步骤3)所得的第二轮扩增产物覆盖成混合样品，再利用高分辨率熔解曲线分析仪器对第二轮扩增产物的基因型突变进行检测。

4.权利要求3所述方法，其特征在于，步骤2)所述第一轮巢式PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸15s，共35个循环，再72℃延伸4min，4℃保温；所述稀释处理，是利用ddH₂O稀释10倍。

5.权利要求3所述方法，其特征在于，步骤3)所述第二轮巢式PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，56.8℃退火30s，72℃延伸10s，共15个循环，再72℃延伸4min，4℃保温。

6.权利要求3所述方法，其特征在于，步骤4)所述利用高分辨率熔解曲线分析仪器对第二轮扩增产物的基因型突变进行检测，是根据目标片段的GC含量的变化在不同熔解温度出现吸收峰的位置判定，突变株的GC含量下降，熔解温度降低，吸收峰在左侧；野生型GC含量增加，熔解温度升高，吸收峰在右侧；杂合型的GC含量居中，吸收峰位于中间温度。

7.权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)提取待鉴定材料的DNA；

2)以步骤1)所得的DNA为模板，以如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所述序列为引物进行第一轮PCR巢式扩增，扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸15s，共35个循环，再72℃延伸4min，4℃保温；所述稀释处理，是利用ddH₂O稀释10倍；

3)以步骤2)中稀释后的扩增产物为模板，以如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.5所述序列为引物进行第二轮巢式PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，56.8℃退火30s，72℃延伸10s，共15个循环，再72℃延伸4min，4℃保温，扩增结束后获得第二轮扩增产物；

4)利用20矿物油将步骤3)所得的第二轮扩增产物覆盖成混合样品，再利用高分辨率熔解曲线分析仪器对第二轮扩增产物的基因型突变进行检测，并将所得熔解曲线与野生型和杂合型样品的熔解曲线进行对比，当待测样品的熔解温度降低，熔解曲线位于野生型和杂合型样品的左侧时，该待测样品即为B1型突变株。

8.权利要求3-7所述任一方法，其特征在于，用于大豆的遗传育种。

9.利用权利要求1所述引物组制备的检测试剂盒。

10.权利要求9所述试剂盒，其特征在于，用于筛选和鉴定大豆脂肪酸脱氢酶合成基因B1型突变体。