[发明专利]基于外源基因旁侧序列鉴定转基因水稻吉生粳2号的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于外源基因旁侧序列鉴定转基因水稻吉生粳2号的方法，及相应的引物和纯合型转基因水稻吉生粳2号特异性PCR扩增片段的核苷酸序列。

背景技术

目前，已报道的转基因作物成分检测方法，主要包括针对外源目的基因和调控元件检测的基因特异性检测方法，针对遗传转化载体的特征建立的载体特异性检测方法，针对外源DNA插入特征序列建立的转基因作物品系特异性检测方法等三类。与前两种方法相比，转基因作物品系特异性检测方法具有最高的特异性，最适合转基因产品的定性和定量检测。由于每个转基因作物品系，外源基因在受体基因组中的整合位点具有随机性，即相同的载体多次转化，整合的位置具有高度的特异性和不可重复性，因此利用外源基因旁侧序列进行品系特异性检测的方法具有特异性和准确性，并且能够鉴别外源DNA插入的纯合或杂合状态。

水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一，是世界上食用人口最多、历史最悠久的农作物。随着转基因技术在水稻中的广泛研究和应用，已经有多个转基因水稻品系进行了环境释放，申请商业化种植。对转基因植物进行品系特异性检测是对转基因植物进行监督管理，保障其健康发展的重要技术基础。目前已经有部分专利和文献报道了利用品系特异性PCR检测方法鉴定转基因植物的方法。张琰等人于2010年根据转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的边界序列设计了科丰6号特异性引物和特异性探针，提供了可以快速检测转基因水稻科丰6号的方法，为转基因安全提供了保证；金芜军等人于2013年基于转基因抗虫水稻品系TT51-1的旁侧序列建立了鉴定纯合型转基因抗虫水稻品系TT51-1的方法。然而，在对现有的专利和文献的分析中发现，国内外目前还没有鉴定转基因抗虫水稻品系吉生粳2号检测方法的相关报道。

发明内容

本发明提供一种基于外源基因旁侧序列鉴定转基因水稻吉生粳2号的方法，及相应的引物，并提供纯合型转基因水稻吉生粳2号特异性PCR扩增片段的核苷酸序列。

为了实现本发明的目的，本发明的一种检测转基因抗虫水稻品系吉生粳2号的3条特异性引物，其包括：

正向引物SEQIDNO.1:ACGAGACATGGCAAAGTTTGATT，

反向引物SEQIDNO.2:CGCGCTTAAAGATATACAAACCA,

T-DNA特异性引物SEQIDNO.3:TAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAG。

该3条引物是基于转基因抗虫水稻品系吉生粳2号外源基因的旁侧序列而设计的引物，其正向引物和反向引物依据水稻基因组序列设计，位于水稻1号染色体(GenBank登记号：NC_008394.4)的41607255-41607277bp和41608280-41608258bp位置，T-DNA特异性引物按照T-DNA左边界区域序列设计，位于T-DNA左边界338-313bp区段。利用该引物在特定的扩增条件下进行聚合酶链式扩增(PCR)，在以纯合型转基因抗虫水稻品系吉生粳2号的基因组DNA为模板可以扩增出一条短片段SEQIDNO.4(446bp)，以杂合型转基因抗虫水稻品系吉生粳2号的基因组DNA为模板扩增出两条片段(1026bp和446bp)，以非转基因水稻的基因组DNA为模板扩增出一条PCR条带(1026bp)。

本发明提供基于外源基因旁侧序列建立的鉴定转基因抗虫水稻品系吉生粳2号的方法，包括步骤：1)提取植物基因组；2)以步骤1)的基因组为模板，利用上述特异性引物进行PCR检测。

PCR反应条件优选为：94℃2min；94℃20s，55℃40s，35个循环；72℃10min。

PCR反应体系优选为：：2μl 200ng/μl模板，康为世纪2×Es Taq MasterMix(含有Es Taq DNA Polymerase,PCR buffer,3mM MgCl₂,400uM dNTP mix),1μl 10μM正向引物，1μl 10μM反向引物，1μl T-DNA特异性引物，补ddH₂O至20μl。