[发明专利]可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肽片段及验证方法

说明书

本发明提供了一种可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肽片段及其验证方法，通过在酵母菌单杂交系统中，对拟南芥AtDPBF4/EEL进行双向缺失突变分析，发现了可在酵母菌细胞中激活基因转录的两个多肽片段AD1和AD2；体外合成AD1和AD2的编码区序列，连接至拟南芥原生质体瞬间表达分析的效应载体pHQEff，重组质粒分别命名为pHQEff‑AD1和pHQEff‑AD2；拟南芥原生质体瞬间表达分析结果表明，AD1和AD2均可激活报告基因(GUS)的表达。本发明多肽片段AD1和AD2的发现为进一步构建抗干旱、耐盐碱转基因植物提供了基础，对基因工程作物的培育和改良具有重要的指导意义。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肽片段及验证方法。

背景技术

AtDPBF4/EEL基因编码了一个碱性亮氨酸拉链类(b-ZIP)转录因子，其表达产物在拟南芥种子胚胎发育晚期基因表达调控，种子萌发以及脱落酸(ABA)信号转导中发挥着重要的调控作用。与其它典型的转录因子一样，AtDPBF4/EEL也含有重要的两个功能域：DNA结合结构域(DBD)和转录激活域(TAD)，前者与基因启动子区的上游激活序列(UAS)结合，后者与一种称为介导因子(Mediator)的蛋白质复合物中的某些区域结合，介导因子还可同时与RNA聚合酶II转录机器相互作用，这些蛋白质-DNA，蛋白质-蛋白质相互作用就激活或抑制了靶基因的表达，从而在转录水平调控相关基因表达的开启或关闭。

以往的研究结果表明，AtDPBF4/EEL中负责与DNA结合的区域就是羧基端的位于碱性亮氨酸拉链区下游的某些氨基酸残基，而负责激活转录的功能域的研究尚处于探索阶段。有研究报道称，转录因子Nrf2与GAL4DBD融合表达至酵母菌细胞时，只表现出微弱地转录激活活性，而将Nrf2的第113至251位氨基酸残基与GAL4DBD融合表达至酵母菌细胞时，则表现出很强的转录激活活性；研究人员在对FHL3缺失突变分析时发现，其LIM4结构域中的第二个锌指结构单独与GAL4DBD融合表达至酵母菌细胞时，可激活报告基因的转录。到目前为止，国内外尚未见AtDPBF4/EEL中能激活基因表达的多肽片段的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肽片段及验证方法，旨在更加深入地解析特定转录因子激活相关生物性状基因表达、培育具期望生物性状的植物/作物的分子途径。

本发明是这样实现的，一种可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肽片段，其特征在于，包括AD1多肽片段和AD2多肽片段，其中，所述AD1多肽片段如SEQ ID NO:1所示(GKPLGSMNLDELLKTVLPPAEE)；所述AD2多肽片段如SEQ ID NO:2所示(NIASNGQWVEYHHQPQQQQGFMTYPVCEMQDMVMMGGLSDTPQAP)。

本发明进一步提供了上述可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肽片段的验证方法，包括以下步骤：

(1)利用PCR技术体外扩增AtDPBF4/EEL基因(Gene ID:818706)形成一系列缺失突变体，扩增的缺失突变体分别连接至酵母菌表达载体pGBKT7，分别将空载的pGBKT7质粒和上述重组质粒转化酵母菌Y187菌株，对各个突变体进行转录激活活性分析；

(2)根据在酵母菌系统中的AtDPBF4/EEL缺失突变分析的结果，合成3’末端相互覆盖的DNA片段，通过链延伸合成出完整的AD1的编码区序列，延伸产物连接至拟南芥叶肉原生质体瞬间表达分析效应载体pHQEff，将重组质粒命名为pHQEff-AD1；通过PCR技术体外扩增出完整的AD2的编码区序列，将扩增产物连接至拟南芥叶肉原生质体瞬间表达分析效应载体pHQEff，将重组质粒命名为pHQEff-AD2；