[发明专利]神经鞘氨醇磷酸胆碱在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及神经鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosylphosphorylcholine，SPC)的新应用，尤其涉及神经鞘氨醇磷酸胆碱在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用。

背景技术

神经鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosylphosphorylcholine，SPC)分子式为：C₂₃H₄₉N₂O₅P，分子量为：464.62，结构式如下：

SPC是一种具有生物活性的鞘磷脂，天然存在于血液内，是高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白的组成成分。SPC除了作为生物膜的组成成分外，也可以作为调节细胞外和细胞内信号转导的信号分子存在。已有报道表明，SPC能抑制血管平滑肌细胞痉挛，调节血管内皮细胞的凋亡，分化和增殖，表现出对心血管细胞的重要生物学活性。例如SPC结合HDL后可以显著地降低小鼠瞬时心脏缺血/再灌注模型中心脏梗死面积，保护心脏免受心肌缺血和再灌注中的伤害并产生抗炎症与抗凋亡作用。但是在已公开的报道中有关SPC在干细胞分化过程中的研究甚少，虽有报道SPC可以诱导间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化，但对于SPC在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用目前国内外尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种神经鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用。

本发明所述神经鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用。

其中：有效促进内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞的神经鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)浓度优选为5μM。

本发明提供的SPC的应用为研制开发促心肌分化的新型药物奠定了基础。本发明所述的SPC还可以作为一种有效的工具，用于内源心脏干细胞的分化的分子机制的研究。

为了更好地理解本发明的实质，下面结合SPC的药理实验和细胞生物学和分子生物学的方法及结果来阐明其在制备促内源心脏干细胞分化为心脏谱系细胞药物中的应用。

1.内源性Sca-1⁺心脏干细胞的制备：以磁珠分选法提取并培养小鼠的sca-1⁺心脏干细胞。

结果显示：第一代(P1)细胞Sca-1⁺阳性率为84.8％，第五代(P5)96.8％，Sca-1⁺细胞CD34阳性率约0.8％，CD45阳性率约3.5-7.3％。表明该制备方法提取的细胞为Sca-1⁺的心脏干细胞，而非造血干细胞。

2.本发明所述SPC药用溶液的制备：配制为5mg/ml的储液。

3.倒置相差显微镜下定时观察SPC对心脏干细胞形态的影响。

结果表明：与溶剂对照组和正常组相比，5μM的SPC可以促进sca-1⁺心脏干细胞拉长。

4.QPCR检测心肌细胞标志物mRNA水平的变化。

结果表明：5μM SPC处理2-3周能显著上调心肌细胞的marker Gata4，Nkx2.5，CTnt，Mef2c等的表达。

5.激光共聚焦技术检测结合western blot，检测心肌细胞标志物蛋白水平变化。

结果表明：5μM SPC能促进细胞内应力纤维的形成，并上调CTnt的蛋白水平表达。

另外，5μM SPC能显著促进心肌特异性转录因子GATA4的入核。

6.QPCR及流式细胞术从mRNA及蛋白水平检测内皮细胞标志物的变化

结果表明：5μM SPC处理2-3周能显著上调内皮细胞的marker CD31及vWF等mRNA水平的表达，及CD31蛋白水平的表达。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：