[发明专利]一种甘蔗无载体框架转基因方法

说明书

本发明提供一种甘蔗无载体框架转基因方法，具体涉及一种甘蔗无载体框架转基因方法，包括以下步骤：1)提取含有Bar基因的质粒；2)制备无载体框架的Bar基因表达盒；3)基因枪转化：将步骤2)获得的Bar基因表达盒制备DNA微弹，用装载有DNA微弹的基因枪轰击甘蔗愈伤组织，对轰击后的愈伤组织进行培养；4)抗性筛选，再生培养。本发明直接将甘蔗愈伤组织作为受体材料，通过基因枪介导Bar基因表达盒来转化甘蔗愈伤组织，培养后进行抗性筛选和再生，获得含有抗除草剂功能的转基因甘蔗，基因转化率高，能够大大降低转基因成本，节省时间。

技术领域

本发明涉及技术领域涉及植物遗传转化领域，具体涉及甘蔗无载体框架转基因方法。

背景技术

植物遗传转化是研究外源目的基因功能和开发转基因植物的有效途径，是开展植物学研究的基础手段之一。近年来，随着转基因植物的商业化种植，转基因作物品种和种植面积逐年增加，产生了巨大的经济效益和环境效益。但是，消费者对转基因作物的安全性要求也越来越高，转化背景简单的转基因植物和高效快速的转基因技术是研究的发展趋势。

甘蔗是一种重要的糖料经济作物，广泛种植于热带、亚热带地区，甘蔗糖占全球食糖总量的70％以上。同时，甘蔗具有高光合效率、高生物产量的特点，是生产乙醇的最佳能源作物。甘蔗属于日中性植物，开花难，同时甘蔗在生产上通过无性繁殖，相比其它转基因甘蔗具有较高的生物安全性，属于转基因安全Ι类植物，具有良好的商业化种植前景。

基因枪转化技术目前已经广泛应用于植物转基因研究，具有适应性广，效率高的特点。目前常规的甘蔗转基因所用的外源基因材料多为含有目的基因的载体，这导致大量载体序列也插入到甘蔗基因组中，导致效率低下，同时也导致转基因甘蔗的遗传背景较为复杂。特别是目前甘蔗基因组还没有完成，导致确定目的基因的插入位点无法完成。目前有通过如pCambia1300系列载体将外源基因导入甘蔗的方法报道，如专利CN201210462236.8公开的一种抗螟虫(BT)和抗除草剂(Bar)共价外源基团导入甘蔗的方法，由于基因枪转化是随机的，避免了载体序列的插入，导致插入片段的随机性和复杂性，造成转化效率低。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种无载体框架的甘蔗无载体框架转基因方法，可利用该方法获得一种转基因甘蔗。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种甘蔗无载体框架转基因方法，包括以下步骤：

1)质粒提取：对含有bar基因的大肠杆菌单菌落进行培养，提取含有bar基因的质粒；

2)Bar基因表达盒的制备：采用核酸内切酶HindⅢ和XhoⅠ酶切步骤1)获得的含有bar基因的质粒，得酶切产物；将酶切产物进行电泳纯化，收集含有启动子、bar基因和终止子的Bar基因表达盒；

3)基因枪转化：将步骤2)获得的Bar基因表达盒制备DNA微弹，用装载有DNA微弹的基因枪轰击甘蔗愈伤组织，对轰击后的愈伤组织进行培养；

4)抗性筛选：使用除草剂进行抗性筛选，再生培养，得到转基因植株。

作为优选，步骤2)中，取步骤1)获得的含有bar基因的质粒，每10μg质粒加入10*buffer 10μL、HindⅢ酶2μL和XhoⅠ酶2μL，加入双蒸水定容至100μL，37℃过夜，得酶切产物。

作为优选，步骤2)中以琼脂糖凝胶为凝胶介质，以核酸电泳缓冲液10×TAEBuffer为电泳缓冲液，进行电泳纯化。

作为优选，步骤3)中，使bar基因沉淀到金粉微粒载体上，制备金粉悬浮液，转移至载物膜上，制得DNA微弹。

作为优选，步骤3)中，轰击条件为：基因枪样品室的真空度为20mM Pa，轰击压力位1100psi，射程为9cm，轰击1次。