[发明专利]一种利用细胞工厂制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的方法

权利要求书

1.一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗，其特征在于，每20ml成品包括：

白油佐剂：12--14ml

病毒培养液：6～8ml

其中每ml病毒培养液中猪繁殖与呼吸综合征病毒含量不低于10^6.5TCID50。

2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为油乳剂灭活疫苗。

3.制备如权利要求1或2所述的疫苗的方法，所述方法包括：

(a)复苏MARC-145细胞；

(b)将所述MARC-145细胞接种至细胞工厂进行单层培养；

(c)将猪繁殖与呼吸综合征病毒接种于所培养的MARC-145细胞；和

(d)收获接种后的MARC-145细胞；和

(e)将所收获的MARC-145细胞病毒培养液灭活加入适量白油乳化，获得所述猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述方法包括：

(1)将MARC-145细胞悬浮于含8％牛血清的DMEM培养基中，之后再培养瓶中培养至细胞单层达到90％以上；

(2)将步骤(1)中所培养的细胞用胰酶消化后接种至细胞工厂中，每层150ml-250ml细胞悬液，盖好进液口盖，放37℃温室中静止培养；

(3)细胞培养48～72小时后，待细胞单层达到70-90％以上，弃去细胞工厂内培养基，接种所述猪繁殖与呼吸综合征病毒，吸附1小时，吸附后加入维持液，将维持液分匀后放入37℃温室中继续培养；

(4)培养至70％及以上的细胞出现致细胞病变效应时收获所述MARC-145细胞，通过反复冻融细胞2次，将所述MARC-145细胞从细胞工厂壁上摇下过滤去除细胞碎片后，收集到无菌容器内；和

(5)加入适量甲醛溶液，混匀，37℃灭活至少18个小时，获得所述猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗。

5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒是NVDC-JXA1株。

6.如权利要求3至5中任一项所述的方法，其中将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒接种于所述MARC-145细胞的方法是将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的工作毒种接种于所述细胞工厂中培养的单层MARC-145细胞。

7.如权利要求3至5中任一项所述的方法，其中将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒接种于所述MARC-145细胞的方法是将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的工作毒种接种于MARC-145细胞悬液中后分装在所述细胞工厂中。

8.如权利要求3至7中任一项所述的方法，其中按3％～5％接种所述猪繁殖与呼吸综合征病毒。

9.如权利要求3至8中任一项所述的方法，其中灭活时按终浓度为0.1％～0.2％比例加入所述甲醛溶液。

10.如权利要求3至9中任一项所述的方法，其还包括将所述猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗以冷冻水循环的方式进行冷却，并于4℃保存。