[发明专利]一种芽孢杆菌的筛选方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌的筛选方法及其应用。

背景技术

番茄(Lycopersicon esculentum Mill)为我国普遍栽培的果蔬之一。据农业部统计，2001年我国番茄栽培面积位居亚洲首位，世界第二。到目前为止，我国每年的番茄栽培面积都稳定在110万hm²左右。因此发展我国番茄生产具有重要的战略意义。

随着番茄栽培面积的不断扩大，栽培品种单一，栽培模式和栽培管理技术不当，番茄病虫害也越来越严重，特别是在保护地栽培的番茄病虫害更为严重。其中番茄青枯病是其中一种非常严重的病害之一，在我国南方各省市番茄种植区域均有严重发生。该病害是由茄科劳尔氏菌(R.solanacearum，EF smith，简称青枯菌)引起的一种世界范围的毁灭性土传细菌病害，在高温、高湿的条件下容易爆发，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，并且在部分低温地区同样发现青枯菌的存在，给全球的农作物生产带来极大的威胁。该病害一旦发生就难以控制，往往造成作物大面积萎蔫死亡甚至绝收，导致番茄产量严重下降，严重制约着番茄产业的发展和经济效益的提高。

青枯菌是引起番茄、茄子、烟草、辣椒等多种经济作物青枯病的病原菌，但尚无有效的方法控制其造成的危害。使用化学农药防治青枯病，不仅经济成本高，而且会污染环境，危害人类健康。因此，利用具有环境友好、持续有效的生物防治技术对土传青枯病进行防控，越来越受广大农业生产工作者的欢迎和关注。其中利用植物根际有益微生物防治土传病害成为生物防治的重要研究领域。利用植物根际有益微生物防治番茄青枯病，并且促进番茄作物的生长，对番茄栽培乃至整个农作物栽培领域都具有十分重要的意义。

生防菌防控植物病害的关键是其能够在植物根际竞争定殖，尤其是有病原微生物的存在于土壤或植物根部时更显得非常重要。室内平板试验中筛选得到的产拮抗物质能力强的拮抗菌因其根际定殖能力差同样未必能达到理想的生物防控效果。但同样有研究指出根际定殖能力强的生防菌株未必就能够能取得很好的生防效果，并且大部分定殖能力强的根际微生物属于革兰氏阴性菌，不利于用于农业生产应用及商业产品的开发。芽孢杆菌因其能耐热抗逆、产内生芽孢，并具有抗逆能力强、功能性强、易储藏运输、分布广泛、防病稳定性高等特点，为其在农业生产中表现出非芽孢杆菌所没有的优势，基于其开发的生防菌剂，以及微生物有机肥等生防产品已成功投入使用并取得了良好的生防效果。但是有些芽孢杆菌在室内平板的拮抗效果很好，但是在土壤中却不能发挥相应的作用。因此，有必要开发和筛选出在根际定殖能力强兼有较强拮抗能力的新的菌株资源，从而为生物防控菌剂的开发提供新的微生物资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有较强根际定植能力和拮抗能力的微生物菌株的筛选方法。

为达到以上目的，本发明提供了一种芽孢杆菌的筛选方法，所述方法包括菌株的植物根际定殖能力筛选和菌株对病原微生物拮抗能力筛选。

可选的，所述方法包括以下步骤：

1)芽孢杆菌的筛选：将采集的土壤样品稀释得到菌悬液，将菌悬液涂布于制备好的LB培养基平板上，然后倒置于30℃培养箱中培养48h，挑取不同形态的、生长良好的单菌落反复划线，纯化分离菌株，并将所获得的单菌落转接至LB培养基斜面上，30℃恒温培养48h，筛选获得芽孢杆菌；

2)植株根际定殖能力筛选及病原微生物拮抗能力筛选：将筛选出来的芽孢杆菌在LB培养基上划线培养后用无菌的磷酸缓冲液冲洗获得芽孢杆菌的混合菌悬液1，然后再将混合菌悬液1接种至限菌条件下培养的植株根际，在植株根际培养一周后再将植株根际的芽孢杆菌分离培养，筛选出数量最多的芽孢杆菌获得植株根际定殖能力强的菌株；再将植株根际定殖能力强的芽孢杆菌与病原微生物进行室内平板对峙试验，挑选抑菌圈大的菌株，即为对病原微生物具有强拮抗能力的菌株。

其中，所述土壤样品可以为生长在植物病原微生物病害严重的地区的健康作物植株的根际土壤。例如，当所要筛选的芽孢杆菌为具有番茄青枯菌抑制能力的芽孢杆菌时，可以取番茄青枯病连作障碍严重地区的健康番茄植株的根际土壤。

可选的，所述植株根际定植能力筛选包括以下步骤：