[发明专利]一种同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法。

背景技术

沙门氏菌是肠杆菌科中主要的致病菌之一，畜禽感染沙门氏菌后可引起一系列疾病。食用感染的食品，会使人食物中毒。在我国，70%～80%的细菌性食物中毒事件都是由沙门氏菌引起的。因感染沙门氏菌而使人中毒的食品中，约90%是肉、蛋、奶等畜产品。

金黄色葡萄球菌可引起多组织的感染，能够在人群中大范围传播而引发多种疾病，有时甚至会危及生命，如菌血症、心内膜炎和肺炎等。并且，金黄色葡萄球菌极易产生抗药性，特别是甲氧西林耐药株的大量出现，已经引起全球范围内的广泛关注。在许多国家由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒居于第二或第三位，是主要的污染源，仅次于沙门氏菌属。

经过各国学者的多年研究，食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测方法日渐成熟，但其不足在在于：检测时间长、敏感度低、成本高，而且不能同步检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

发明内容

本发明目的旨在于提供一种同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法。

基于以上目的，本发明采取以下技术方案：

一种同时检测食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：

1）参照GB 4789对待测食品样品进行稀释，得到1:10的样品匀液；向样品匀液中加入质量浓度为50-65%的氨基三乙酸溶液，样品匀液与氨基三乙酸溶液的体积比为5-7:1，振荡，加入磷酸盐缓冲液或含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液后离心分层，弃上层；

2）向经步骤1）处理后的样品添加免疫磁珠混合、振荡后，于磁力架上静置分层，弃上层，对下层样品进行洗涤；所述免疫磁珠采用链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体制得；

3）向洗涤后的样品中添加磷酸盐缓冲液，振荡，涂于LB平板，培养观察。

所述步骤2）中，洗涤操作为：加入洗涤液混合均匀后，置于磁力架上静置分层，弃上层，洗涤1-3次，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）或含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST缓冲液）。

步骤1）中采用超声波进行振荡，振荡温度为30-37℃，振荡时间为1-15min。

步骤2）中，下层样品与免疫磁珠按照1：1.5-2的体积比进行混合、振荡，振荡温度为25-60℃，振荡时间为15-60min。

所述磷酸盐缓冲液和含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液的浓度均为0.01mol/L。

所述待测食品为牛奶、鸡蛋、猪肉或速冻水饺。

链霉亲和素修饰磁珠偶联生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体所得的磁珠的制备方法，包括以下步骤：

a）用0.01mol/L PBST缓冲液（pH 7.4，Tween-20）稀释沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体到1mg/ml；用无水DMSO配制10mg/ml生物素N—羟基琥珀酰亚胺酯溶液（BNHS溶液），BNHS溶液加入稀释的抗体中进行混合，BNHS溶液与稀释的抗体体积比为4:1，室温下，孵育，即得生物素标记的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抗体。

b）加入1mg已活化溶解的链霉亲和素修饰磁珠进行混合，室温放置；

c）加入9.6μL 1mol/L NH₄Cl溶液，室温孵育；上1ml的分子筛柱，以PBS缓冲液洗脱，收集1ml/管，加入PBS缓冲液与0.01%叠氮钠的混合液，置4℃，置-20℃避光保存。

免疫磁珠制备时，高浓度的BNHS溶液会导致多个生物素分子结合在抗体上，因此可能会使所有抗体都被标记，较低的比率则会是使生物素化保持在最低限度，所以选择用无水DMSO配制10mg/ml BNHS；由于抗体的氨基不易接近可能造成生物素化不足，此时可加入去污剂如Tween-20，将抗体溶液用PBST缓冲液透析，以除去未结合的生物素，防止在反应混合液中有叠氮钠或游离氨基存在，会抑制标记反应。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果：

1）氨基三乙酸对金属离子具有螯合作用，可以夺取酪蛋白胶素中的Ca²⁺，使其解离成小分子酪蛋白单体，从而克服样品在快速过滤富集过程中的阻碍作用，达到顺利、快速富集待检目标菌；