[发明专利]一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体，其特征在于，该表达载体为pBI-3-LacZ-cre，且该表达载体中含有LacZ报告基因、Cre重组酶基因及双向启动子tetO元件。

2.根据权利要求1所述的一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体，其特征在于，所述cre重组酶基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

3.一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体的构建方法，其特征在于，该真核表达载体pBI-3的双向启动子tetO的一侧为LacZ报告基因，在另一侧插入cre重组酶基因，构建得到真核表达载体pBI-3-LacZ-cre。

4.根据权利要求3所述的含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以引物对P1为引物，以包含cre重组酶基因的pET32a-cre载体为模板，PCR扩增基因，得到cre重组酶基因扩增片段；

2)用限制性内切酶PstⅠ和SalⅠ双酶切表达载体pBI-3-LacZ并回收大片段产物，将cre重组酶基因扩增片段用限制性内切酶PstⅠ和SalⅠ进行双酶切，并回收产物；

3)将步骤2)酶切回收的两个产物用T₄DNA连接酶连接，得到含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体pBI-3-LacZ-cre。

5.根据权利要求4所述的含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体的构建方法，其特征在于，步骤1)所述的引物对P1为：

上游引物：AACTGCAGGCCACCATGGCCAATTTACTG；

下游引物：ACGCGTCGACCTAATCGCCATCTTCCAGCAG；

步骤2)所述的大片段产物包含插入的cre重组酶基因和调控元件，大小为7521bp。

6.根据权利要求3或4所述的含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体的构建方法，其特征在于，所述cre重组酶基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

7.权利要求1所述的含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体在抗HBV抑制剂筛选中的应用。

8.一种构建肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠的方法，其特征在于：首先，将权利要求1所述的表达载体导入小鼠输卵管内进行妊娠，获得转基因小鼠；然后，将可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的rTA^LAP-1转基因小鼠、可调控表达HBV基因组的HBV Tg小鼠和转基因小鼠进行杂交，经反复交配，得到肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠。

9.如权利要求8所述的构建肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠的方法，其特征在于：在可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的rTA^LAP-1转基因小鼠的表达载体中含有肝脏特异性启动子和rtTA元件。

10.如权利要求8所述的构建肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠的方法，其特征在于：可调控表达HBV基因组的HBV Tg小鼠的表达载体为pBI-3-Luc-pA-HBVTg-EGFP，含有LacZ报告基因-双向启动子tetO-loxP-Luciferase-polyA-loxP-HBVTg-IRES-EGFP报告基因的元件。