[发明专利]李痘病毒主要株系杂交探针及基因芯片的制备方法及检测

说明书

本发明公开了一种李痘病毒主要株系杂交探针及基因芯片的制备方法，所述探针包括：PPV‑D；PPV‑M；PPV‑EA；PPV‑Rec；PPV‑W；PPV‑C。一种基因芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：制备基因芯片点样；PCR扩增与样品标记；芯片预处理；芯片的杂交；芯片的清洗；芯片的扫描分析；数据处理与结果判定。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测李痘病毒主要株系杂交探针；本发明还涉及一种包括上述探针的基因芯片的制备方法。

技术领域

本发明涉及一种用于李痘病毒主要株系杂交探针，本发明还涉及一种包括该探针的基因芯片的制备方法，本发明还涉及一种采用上述基因芯片检测李痘病毒的方法，属于生物技术领域。

背景技术

李痘病毒Plum pox virus,PPV是我国2007年颁布的进境植物检疫性有害生物，是核果类果树危险性最大的病毒之一，属于马铃薯Y病毒科Potyviridae中的马铃薯Y病毒属Potyvirus，其自然寄主主要是李属的木本植物，侵染李、杏、桃、樱桃等核果类果树后，使叶片和果实均受到严重危害，未成熟果实大量脱落，造成果实品质下降，产量降低。病毒远距离扩散则主要靠感染病毒的植物繁殖材料的调运。根据病毒的来源和侵染植物的不同，该病毒的目前主要株系有6个，它们分别为PPV-D,PPV-M，PPV-C,PPV-EA,PPV-W,PPV-Rec，其中D株系和M株系是目前最主要的流行株系。

广东地处我国的南方开放地区,地理环境优越,每年经过广东辖区口岸的进出境种子、苗木等容易携带该病毒的材料数量众多,由于进出境批次多,数量庞大,急需研究出即能保证检测速度快、灵敏度要高、而且检测通量高的方法,由于苗木带毒率低，只有加大样品的抽样量才能避免漏检和保证检测率，而对于大量样品的检测，就必须有检测高通量的仪器设备和方法，本课题就是针对这一病毒检测的要求，利用基因芯片技术来研究李痘病毒主要不同株系的检测方法，以便最大限度的提高该病毒的检出率和防止漏检，对保证我国农业生产可持续健康的发展具有非常重要的意义。

目前无论国外国内，植物病毒的检测方法主要有如下4种：一是传统的生物学方法，其特点是周期长，准确度低，检测病毒数量少，劳动强度大，；二是电子显微镜方法，但它只能观察病毒粒体形态，不能鉴定病毒种类，而且操作复杂，价格十分昂贵；三是酶联免疫吸附分析法，是目前应用最广的病毒检测方法，但其检测时间长，操作步骤多，而且需要专用仪器和购买昂贵的特异性抗血清；四是PCR方法虽然灵敏度非常高且快速，但更需要专用仪器和专业人员，而且检测通量非常有限。

由于植物病毒的特殊性，即一般种子和苗木带毒率是非常低的，加上进出境量通常非常之多，如果抽样量过少，则漏检的机率就一定非常之大，把关作用就会大大消弱；为了最大限度的提高检测率，避免漏检，就必须加大抽样量，这样就会导致样品众多，不仅会加大检测的工作量，而且会极大的影响检测速度，推迟通关速度，进而影响进出境贸易的正常进行，因此急需具有高通量检测的仪器设备和方法，而基因芯片技术正好适合这一要求。

基因芯片gene chip的最早是80年代中期提出的，其本质上仍然是核酸分子杂交方法，具体系指将大量，通常每平方厘米点阵密度高于400，探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交Southern Blotting和Northern Blotting等技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足；而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。

目前基因芯片技术已经在许多方面得到了广泛的应用，但是在李痘病毒主要不同株系检测鉴定方面还未见诸报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测李痘病毒主要株系杂交探针；