[发明专利]α-地中海贫血基因突变检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因组突变检测领域，特别涉及人类α-地中海贫血基因检测和人类胚胎α-地中海贫血基因检测。

背景技术

地中海贫血(以下简称地贫)分为α-地中海贫血和β-地中海贫血。α-地中海贫血(以下简称α-地贫)，是一组因α-珠蛋白链合成减少或不能合成，α-链/非α-链比例失衡为特征的遗传溶血性血红蛋白病。地贫是世界上最常见的人类单基因遗传血液病之一，被世界卫生组织列入危害人类健康的6种常见病，也是中国南方各省最常见、危害最大的遗传病。在我国南方α-地贫的高发区，总发病率为2.46％，其中广西、广东、江西、四川和浙江各省(区)的发病率分别为14.95％、4.11％、2.60％、1.92％和1.20％。

人类α-珠蛋白基因簇位于16号染色体，每条染色体各有2个α-珠蛋白基因。大多数α-地贫是由于α-珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成。若仅是一条染色体上的一个α-基因缺失或缺陷，则α-链的合成部分受抑制，称为α+地贫；若有一条染色体上的2个α-基因均缺失或缺陷，称为α0地贫。重型α-地贫是α0地贫的纯合子状态，其4个α-珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α-链生成。中间型α-地贫是α0和α+地贫的杂合子状态，是由3个α-珠蛋白基因缺失或缺陷所造成，患者仅能合成少量α-链。标准型α-地贫(轻型)是α+地贫纯合子或α0地贫杂合子状态，它仅有2个α-珠蛋白基因缺失或缺陷，故有相当数量的α-链合成，症状轻微。静止型α-地贫是α+地贫杂合子状态，它仅有一个α-基因缺失或缺陷，α-链的合成略为减少，症状非常轻微。目前在中国发现的α-链缺失突变有17种，最常见的有SEA、4.2kb和3.7kb三种缺失型及CS、WS和QS三种点突变。目前，α-地贫还没有效的根治方法，主要以预防为主。因此开展检测，提早发现地贫异常基因的携带者对指导婚前及产前诊断具有重要的意义。

遗传病起因于上代生殖细胞和受精卵的遗传物质突变。杜绝遗传病患儿的出生仍是目前最有效的手段，以往通过产前诊断在妊娠16-20周进行选择性流产，阻止患儿的出生。植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)是辅助生殖技术和分子生物学技术相结合而发展起来的一门新的诊断技术，通过胚胎活检技术获得1～2个卵裂球进行遗传学诊断分析，选择正常、无缺陷的健康胚胎植入子宫继续妊娠，达到优生的目的，可以避免传统的产前诊断技术引起的出血、感染等并发症以及流产和引产给孕妇造成的身心痛苦，并避免由此引起的伦理上的争议。目前还没有已经商品化试剂盒用来进行胚胎植入前α-地中海贫血诊断，本发明属于国内首创，提供了一种高覆盖率的试剂盒来满足临床应用的需求。

PGD的分析材料极为有限，通常仅为1～2个细胞，对诊断技术的敏感性和特异性要求高，同时子宫的种植窗时间短，要求在尽可能短的时间得到诊断结果。PCR以一对与待检测目的DNA片段起始与结束部位碱基互补的寡核苷酸为引物，经反复变性、退火、延伸，实现目的DNA的对数扩增，具有极高的检测敏感性和特异性；少量的DNA模板在数小时内就可以扩增大量的拷贝数。但由于单细胞内基因组DNA的含量约10pg，目的基因模板仅1～2个拷贝，扩增后特异性产物量达不到检测水平，使诊断的特异性和敏感性降低。巢式PCR是改良的PCR。巢式PCR有内外两对引物，PCR反应分两步。在首轮外侧引物PCR中，反应模板是单细胞裂解产物，外侧引物与目的基因配对连接，扩增引物间的特异性片段。然后以此PCR产物为模板，应用内侧引物引导扩增产物内的DNA片断，使目的基因产量进一步增加。巢式PCR大大提高了PCR技术的灵敏度、特异性和精确度。

PCR虽然灵敏，但应用于PGD的时候，存在污染、等位基因脱扣、扩增失败等缺点。单细胞PCR的扩增失败率大约是5％～10％。扩增失败可能与样本的准备过程有关，如未移入细胞、靶DNA的丢失和变性以及细胞的裂解过程。污染是导致误诊的重要原因，通过设立严格的阴性和阳性对照、严格的实验室操作以及单精子卵胞浆内注射技术的应用可以减少污染。等位基因脱扣(allele dropout,ADO)是指在单细胞扩增时，杂合子的两个等位基因之一出现扩增，而另一个等位基因无扩增产物。ADO是导致误诊的主要原因之一，通常有5％～20％的单细胞扩增出现等位基因脱扣。其发生机理复杂，可能与染色体嵌合体、部分二倍体细胞中存在单倍体细胞和PCR变性的温度有关。

发明内容

为了克服现有技术的上述局限性，本发明人设计了一种基于高通量测序技术检测α-地贫的方法。

一、定义