[发明专利]酶促cGAMP生成量检测所用RNA适配体及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种酶促cGAMP生成量检测所用RNA适配体及检测方法。

背景技术

环鸟苷----腺苷酸(cGAMP)是由鸟苷三磷酸(GTP)和腺苷三磷酸(ATP)通过两个磷酸二酯键形成的杂合环状分子(分子结构如图1所示)，该分子是继新型第二信使分子环二鸟苷酸(c-di-GMP)和环二腺苷酸(c-di-AMP)发现之后，新发现的第二信使分子。

cGAMP最先由Davies等（Cell，2012，149（2）：358-370）在研究霍乱弧菌(Vibrio cholera)毒力岛相关基因时发现的。他们发现其中一个毒力基因表达一个新型的环二核苷酸合成酶VC0179，该酶利用ATP和GTP作为底物合成cGAMP，合成的cGAMP影响霍乱弧菌在肠道定植、菌群的趋化和代谢。

2013年Chen, Z. J研究组（Science，2013，339（6121）：826-830）发现真核细胞内也存在cGAMP，他们研究发现L929细胞经外源DNA（ISD，poly(dA:dT)，poly(dI:dC)，HT-DNA）刺激后，细胞内产生一种对热稳定性的环二核苷酸小分子cGAMP，该分子是由真核细胞内的cGAMP合成酶(cGAS)感受外源DNA分子刺激后利用ATP和GTP合成的，合成的cGAMP与细胞内的干扰素基因刺激因子(sting)结合，诱导sting活化，活化的sting蛋白激活干扰素相关因子3(IRF3)，进而诱导细胞产生I型干扰素，调节细胞的天然免疫应答反应。最新研究表明cGAMP可以作为潜在的免疫佐剂提高疫苗的免疫能力(PLOS One，2014，9(10): e110150)。

由于cGAMP在调节天然免疫应答方面的巨大潜在应用价值及其作为新型的免疫佐剂巨大的市场应用前景，人们对于cGAMP的合成及检测表现出了巨大的兴趣。就现有技术而言，目前获得cGAMP的途径主要有两种：一种是通过化学合成方法获得，但其步骤繁琐，价格昂贵，限制了它的广泛应用；另一种普遍采用方法是利用cGAMP合成酶(cGAS)进行体外酶促反应生成，这种方法所制备的cGAMP成本低廉，操作简单，具有广阔的应用前景。但是不管哪种方法所制备的cGAMP，都面临一个检测其含量的问题。

现有技术中，检测体外酶促反应cGAMP生成量的方法主要有反相高压液相色谱分析法(HPLC)和薄层层析法(TLC)两种。HPLC法原理是：采用高压输液系统，将样品经流动相输入固相的色谱柱中，根据样品的不同组分在色谱柱中的结合程度不同，从而将不同组分依次洗脱。但是由于HPLC检测需要昂贵的仪器设备，而且样品处理繁琐，检测时间长，检测成本较高，因而具有很大的局限性。TLC法属于一种固-液吸附色谱法，其原理是：通过虹吸作用，流动相沿层析板上的固定支持物展开，在此过程中样品中的不同组分因在固定支持物中的展开距离不同从而被分开。该方法虽然操作较为简单，但是由于检测过程需用到放射性标记材料，容易给操作者带来潜在的身体危害，且由于单次检测样品数量较少，因而在实际应用中也受到了较大的限制。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于体外酶促反应cGAMP生成量检测所用的RNA适配体，同时提供了一种基于该RNA适配体的体外酶促反应cGAMP生成量的检测方法。该方法相较于现有的cGAMP生成量检测方法，具有操作简便、安全无风险、检测成本较低等特点。

本发明所采取的技术方案如下。

一种体外酶促反应cGAMP生成量检测所用RNA适配体，该RNA适配体包括spinach2，VC2/g20a和tRNA三部分，碱基序列如SEQ ID NO.1 所示，即：

GCCCGGAUAGCUCAGUCGGUAGAGCAGCGGCCGGAUGUAACUGAAUGAAAUGGUGAAGGACGGGUCCACACGCACAGAGCAAACCAUUCGAAAGAGUGGGACGCAAAGCCUCCGGCCUAAACCAGAAGACAUGGUAGGUAGCGGGGUUACCGAUGUUGUUGAGUAGAGUGUGAGCUCCGUAACUAGUUACAUCCGGCCGCGGGUCCAGGGUUCAAGUCCCUGUUCGGGCGCCA；

该RNA适配体具有二级结构，具体如图2所示，其中spinach2部分作为荧光检测指示部分，用于结合类似荧光素的小分子化合物，如DFHBI，从而形成类似绿色荧光蛋白的复合物；VC2/g20a部分用于特异性的识别、结合底物分子cGAMP；而tRNA部分则用以增加RNA适配体整体结构的稳定性。