[发明专利]DNA分子克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域。具体地，本发明涉及一种DNA分子克隆的方法。

背景技术

DNA分子克隆技术是分子生物学中的常规和基础技术，在分子生物学研究中具有重要作用。传统的酶切连接法是最早并且至今仍然广泛使用的DNA克隆技术，它利用限制性酶切消化和DNA连接酶进行连接。但这种传统方法也存在着一些明显的局限，例如关键的酶切位点可能出现在需要组装的序列中，以及较难利用这种技术进行2个以上DNA片段的克隆。Daniel Gibson于2009年发明了一种新的克隆方法—Gibson拼接法，用于DNA片段的直接拼接和克隆。Gibson拼接法是一种简单的等温一步拼接法，且不依赖于DNA片段上的序列，只需将DNA片段或DNA片段与线性化载体混合，加入T5核酸外切酶、Phusion聚合酶和Taq连接酶，在50℃反应1小时即可完成拼接。

但是Gibson拼接法只能将DNA克隆到线性化的载体，因此反应前需将质粒载体通过PCR扩增或酶切的方法进行线性化。现有技术未能提供一种快速有效的将DNA直接克隆到环形质粒载体上。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明第一方面提供一种DNA分子克隆方法，其包括如下步骤：获得含有ccdB基因的目标载体，所述ccdB基因两端分别具有SfiI酶切位点和第一接头序列及第二接头序列，所述第一接头序列和第二接头序列为15-30bp，所述第一接头序列和第二接头序列分别在SfiI酶切位点两侧；获得目标基因，所述目标基因两端分别带有第三接头序列及第四接头序列，其中所述第一接头序列与第三接头序列序列一样，所述第二接头序列和第四接头序列一样；优选的，第一接头序列为ACCTAGGTTCTGGGCCAGGA，第二接头序列为CCTGAGACCGAAGGCCCAGA。将所述含有ccdB基因的目标载体与所述目标基因，SfiI酶和Gibson克隆反应液混合反应。在本发明一个优选的实施例中，所述ccdB基因带有的SfiI酶切位点和第一接头序列通过PCR扩增引入。

在本发明一个优选的实施例中，所述PCR扩增所用的引物为：上游引物FP(SEQ ID NO:1)：GAGACCTAGGTTCTGGGCCAGGATGGCCATTCTCGACTAAGTTGGCAG，下游引物RP(SEQ ID NO:2)：AACCACCTGAGACCGAAGGCCCAGATGGCCCTGTGTATAAGGGAGCCTG，

在本发明一个优选的实施例中，所述PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收后克隆到重组载体中。

在本发明一个优选的实施例中，所述目标基因带有的第二接头序列通过PCR扩增引入。

在本发明一个优选的实施例中，所述目标基因为拟南芥VIP1基因，更优选的，所述PCR扩增的上游引物FP-1(SEQ ID NO:4)：ACCTAGGTTCTGGGCCAGGAATGGAAGGAGGAGGAAGAGG，以及下游引物RP-1(SEQ ID NO:5)：CCTGAGACCGAAGGCCCAGAGCCTCTCTTGGTGAAATCCA。

在本发明一个优选的实施例中，所述目标基因为拟南芥ABCG11基因，更优选的，所述PCR扩增的上游引物FP-2(SEQ ID NO:6)：ACCTAGGTTCTGGGCCAGGAATGGAGATAGAAGCAAGCAGAC，以及下游引物RP-2(SEQ ID NO:7)：CCTGAGACCGAAGGCCCAGACCATCTGCGAGCTCCATCTG。

在本发明一个优选的实施例中，将所述含有ccdB基因的目标载体与所述目标基因，SfiI酶和Gibson克隆反应液进行混合反应，反应条件为50℃反应60分钟。

在本发明一个优选的实施例中，在将所述含有ccdB基因的重组载体与所述目标基因，SfiI酶和Gibson克隆反应液混合反应的步骤后，取5μL反应混合物转化大肠杆菌E.coli感受态细胞，随机挑选6个菌落进行鉴定。

本发明另一方面提供一种目的基因的重组载体，所述载体由上述DNA分子克隆的方法而制备。

本发明的提供的技术方案与现有技术相比，具有以下的优点：

第一，现有技术中的Gibson克隆只能将基因克隆到线性化载体上，因此克隆前需要先通过酶切或PCR扩增将质粒载体线性化。而本方法利用ccdB基因和SfiI酶，能通过Gibson反应将基因直接克隆到环状质粒载体，省去了载体的线性化这一步操作，节约了时间和成本。