[发明专利]一种猪脂肪细胞外基质的提取工艺

说明书

技术领域

本发明属于医学和生物材料技术领域，涉及一种猪的脂肪细胞外基质的提取方法。

背景技术

注射用填充材料在临床中可用于治疗面部凹陷、畸形，可用于改变患者的外形从而满足更高的审美要求，目前在临床中使用较多的注射用填充材料有透明质酸、胶原蛋白等，然而它们具有易于被吸收，生物活性差等缺陷。细胞外基质是由动物细胞合成并分泌到细胞外，分布在细胞表面或细胞间的大分子，主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚糖。细胞外基质不仅为细胞提供了一个支持结构和附着位点，而且通过与细胞的粘附分子、生长调节因子、结合蛋白、蛋白水解酶以及酶抑制剂相互作用，而对细胞的粘附、迁移、增殖、分化以及基因表达的调控发挥重要的调节作用。由于细胞外基质具有以上生物活性作用，具有与天然组织器官相似的三维空间结构，其作为支架材料被广泛应用于组织工程中。目前已被成功提取细胞外基质的组织器官包括小肠粘膜、心脏瓣膜、血管、皮肤、神经、骨骼肌、胎盘、膀胱和肝脏。脂肪的来源广，可以从脂肪中提取到丰富的细胞外基质，研究证明外基质作为生物材料能够促进多种组织再生。

目前被用作注射用填充材料的脂肪外基质主要是提取自抽脂患者的脂肪，冻干后的外基质被制备成粉末状，可以通过20ml注射器针头，从而达到注射用填充材料的效果。脂肪外基质粉末具有多孔样结构、表面积大、颗粒体积和形状具有高度的多样性，有利于细胞的粘附、增殖和迁移，在脂肪外基质和脂肪干细胞联合注射的实验中观察到，脂肪干细胞向脂肪细胞分化，同时周围组织血管和脂肪大量形成。目前文献报道(察鹏飞，高建华，陈阳等，人脂肪组织细胞外基质支架的构建，中华整形外科杂志，2012，28(1)，55-60)的脂肪抽吸术获取的脂肪提取外基质的方法如下：收集同一患者脂肪组织约300ml，蒸馏水充分洗涤，将膨胀液及血液成分洗涤干净，低速离心机1000r/min离心3min，去除上层的游离脂滴及下层的水分，收集纯脂肪组织约100ml。共重复7次。向收集的脂肪组织中按脂肪：水分＝2:1的比例加入50ml蒸馏水，转移至匀浆机，10000-12000r/min匀浆3min，将匀浆后的混合物3000r/min离心5min。去除上层的游离脂滴及中层的蒸馏水，底层乳白色沉淀物为ECM。加入同等体积的蒸馏水洗涤3-5次，将脂滴去除干净。收集ECM，约10ml，去除上层的水分。

目前技术存在的不足：(1)选用人的脂肪提取外基质，来源较少，不易批量生产，不易形成产业化；(2)运用人的脂肪外基质进行自体移植时，患者需要先进行抽脂手术，之后需要等待外基质的提取，再进行二次手术，增加了患者的痛苦和并发症发生的风险，并且体脂少或恶病质的患者抽脂手术不能顺利进行，无法获取足够的材料进行外基质的提取，从而限制了该技术的应用；(3)运用人的脂肪外基质进行异体移植时，涉及到了伦理问题，同样面临着脂肪来源少的问题。

发明内容

本发明的目的在于为克服上述现有技术的缺陷，采用猪脂肪作为原材料并提供一种新的细胞外基质提取工艺。

本发明采用以下技术方案实现上述目的：一种猪脂肪外基质提取方法，包括如下步骤：

(1)将新鲜猪脂肪剪碎后用蒸馏水反复洗涤5-7次，直到洗去脂肪中混合的血液成分，将干净的脂肪碎块挤压成浆糊状，置入烧杯中称量体积；

(2)将浆糊状的脂肪放入匀浆机中，并向匀浆机中加入等体积的蒸馏水，匀浆，匀浆机转速为12000rpm，在室温常压下匀浆5min；

(3)将匀浆后的组织悬液置于震荡摇床中震荡，可观察到白色脂肪与粘稠凝胶样物质逐渐分离，弃去上层脂肪与中层液体，加入等量蒸馏水，重复以上操作，直到全部脂肪分离出凝胶样物质；

(4)将获取的凝胶样物质分装入50ml离心管中，向各个离心管中加入适量蒸馏水，置入离心机中离心，转速为1000rpm，在室温常压下离心3min，离心后弃上层液体，重复3次，最终获得的凝胶样沉淀即为猪的脂肪细胞外基质。

其中，所述的步骤(1)中，猪的脂肪取自皮下脂肪，品系不限。

所述的步骤(3)中，震荡摇床的转速为240rpm，震荡幅度为20mm，在常温常压下震荡5min。

应用本发明确定的方法，可以成功提取猪脂肪外基质。本生产工艺与现有的人脂肪外基质提取工艺相比，采用了猪脂肪作为原料，其来源更为广泛，且不涉及伦理问题，可进行批量生产，克服了使用自体脂肪外基质的限制，对该材料进一步脱细胞处理后可生产为生物填充材料。