[发明专利]基于DNA三叉结构的荧光探针检测Hg2+浓度的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于汞离子检测领域，涉及一种采用DNA检测汞离子浓度的方法，尤其是一基于DNA三叉结构的荧光探针检测Hg²⁺浓度的方法及应用。

技术背景

汞被认为是分布最广泛的重金属污染物之一，以不同的形式存在(有机、无机形式存在或者作为复合物)于环境当中，可以通过食物链在人体内富集，汞摄入过量会引起许多健康问题，例如：DNA损伤、脑损伤、器官功能损坏、免疫系统内稳态的破坏。在水生生态系统中，二价汞离子(Hg²⁺)的生物甲基化会产生神经和基因毒性的甲基汞，所以开发对环境和食品中Hg²⁺的检测十分必要。

Katz在1963年提出，当在天然DNA中加入汞离子后，汞离子会导致DNA中胸腺嘧啶的滑动并形成由汞离子连接的金属离子碱基对，并提出了汞离子与胸腺嘧啶以1：2的比例形成了T-Hg²⁺-T结构的假设，这个假设也在后面的研究中被证实了。近年来，日本科学家AkiraOno和HumikaTogashi小组用熔解曲线、电喷雾电离-质谱和核磁共振等手段证实了汞离子在DNA中形成T-Hg²⁺-T结构，将两个胸腺嘧啶桥连在一起的(如图7)，并且，T-Hg²⁺-T的形成不会对DNA的双螺旋结构及电子传递特性产生明显影响。

目前检测汞离子的方法有电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、原子吸收光谱测定法(AAS)、氢化物发生-原子荧光光谱法、冷蒸汽原子荧光光谱等几种。尽管这些方法具有高度灵敏性，能进行多组分分析，但是成本高，耗时长并且操作复杂，随后又发展了一些基于有机发色团、有机荧光小分子以及共轭聚合物的传感技术。这些方法相对于传统方法具有简单、经济、快速的优势，但是却有水溶性差、灵敏度低、选择性局限的缺点，因此，人们迫切需要简便、快速、经济、准确的Hg²⁺检测分析方法。

荧光分析法是一种由试样溶液中荧光物质所发生的荧光强度的变化来测定试样溶液中荧光物质含量的方法，它具有简单快速、灵敏度高、选择性好等多种突出优点。DNA荧光探针对生物分子影响较小，荧光信号具有分析检测手段简单，灵敏度高等优势。在以往的研究中，已经开发出来一种基于分子信标(molecularbeacon,MB)的方法，基本的思路是在汞离子的作用下‘打开’(turn-on)或者‘关闭’(turn-off)分子新标，以造成可检测的荧光值的变化，根据此来检测溶液中二价汞离子的浓度(具体原理见图7)，这种方法相对简单，易操作，灵敏度高，但是分子信标的两端被荧光发色团(fluorophore)和荧光猝灭团(quencher)占据，这就可能影响了其他标记的用，更重要的是这种分子信标的方法容易出现假阳性的问题，这些都影响了其在实践中的应用。

现有专利文献中公开了与本申请相关的几篇专利文献，具体内容如下：

CN102912011A公开了一种基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg²⁺检测芯片及方法，利用了Hg²⁺能特异性地与两条相邻全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸链上的T碱基共价结合，形成稳定的分子间T–Hg²⁺-T结构，进而诱导与全T寡核苷酸链杂交的互补链的释放。制备包括三个步骤：首先将检测探针固定在经化学修饰的玻片上，然后将荧光标记以及淬灭基团标记的互补链分别与其杂交。使用芯片时只需将待测样品添加到芯片上并保持一段时间，冲洗后利用荧光芯片信号分析系统扫描芯片，通过分析荧光信号的变化即可实现对Hg²⁺的检测。样品中Hg²⁺浓度越高，荧光信号增强得越多。检测的Hg²⁺的浓度范围是10nM-100μM，具有很好的离子选择性。

CN104263837A公开基于三重信标修饰的金纳米粒子三聚体的表面增强拉曼散射效应检测水溶液中Hg²⁺和/或Ag⁺的方法，属于重金属离子的检测技术领域。包括通过制备BPS包裹的金纳米粒子、设计核酸探针、信标分子的修饰和重金属离子Hg²⁺和/或Ag⁺的检测等步骤。本发明提供了一种基于三重信标修饰的金纳米粒子三聚体的拉曼信号来检测水溶液中二价汞离子和/或银离子的方法，并且可以做到同时检测这两种离子，此种方法工作量少，节约成本，灵敏度高，方便快捷。